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烟草曲叶病(Tobacco leaf curl disease, TLCD)是由双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)病毒侵染引起的一种烟草病毒病害,是热带及亚热带烟区的主要病害之一。自1973年在云南首次报道TLCD之后,在我国的其他烟区如福建、台湾、广西、广东、吉林及黑龙江等地也相继发现该病害,但四川烟区是否存在烟草曲叶病未见报道。目前,国内外报道能引起TLCD的病毒近20种,国内已报道有7种双生病毒侵染烟草引起TLCD。本实验室在开展四川省双生病毒调查的过程中发现烟草上具有TLCD的典型症状,为了弄清四川烟区烟草曲叶病的发生情况以及病原种类,为该病害的防控提供理论基础,对四川烟草疑似TLCD样本进行了病原分子鉴定,并基于鉴定结果,利用一种快速、简单、方便的新型分子生物学技术-环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP),构建了四川TLCD病原之一的中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus, TYLCCNV)的LAMP检测体系。本文主要研究内容如下：1、四川烟草曲叶病病原分子鉴定及全基因组扩增利用双生病毒的简并引物PA/PB从23份四川烟草样品中均扩增到大约500bp的特异性片段,随机选取4个阳性样品进行克隆测序,并将序列与GenBank已登录序列进行比对,结果表明,这4条序列均为TYLCCNV的特异片段。为了进一步明确样品中是否还存在其它的双生病毒,本研究采用四川和云南常见双生病毒的特异性引物进行扩增,结果从样品中扩增到了中国番木瓜曲叶病毒(Papaya leaf curl China virus, PaLCuCNV)的约700bp的特异性条带。随机分别选取一个TYLCCNV和PaLCuCNV的阳性样品,对其DNA-A全基因组进行克隆测序分析。结果表明,TYLCCNV-SC230的DNA-A全基因组为2738bp,与我国TYLCCNV各分离物的核苷酸序列相似性均在90%以上,与四川分离物TYLCCNV-SC226(JX679252.1)的相似性最高,为99.2%; PaLCuCNV DNA-A全基因组为2748bp,与我国PaLCuCNV各分离物的核苷酸序列相似性均在90.9%以上,与广西的番茄分离物PaLCuCNV-G30(AJ558117)的相似性最高,为99.2%。两者均具有典型的Begomovirus属病毒的基因组结构特征。TYLCCNV和PaLCuCNV的特异性引物检测结果表明,23份样品中TYLCCNV的侵染率为100%, PaLCuCNV的侵染率为34.8%。利用双生病毒卫星DNAβ的通用引物Beta01/Beta02,对23份样品进行了PCR扩增,均得到约1.3kb的特异性条带。选取样品SC230和SC379中扩增到的DNAβ分子进行克隆、测序,分别获得1337bp和1339bp的全长序列,两者均为TYLCCNV伴随卫星分子,与TYLCCNB其他分离物核酸相似性比较发现,SC230的TYLCCNB与来自四川的分离物SC65(GU199589)相似性最高,为85.3%,SC379的TYLCCNB与来自云南的分离物YN148(GU058279)相似性最高,为95.7%。2、建立快速检测TYLCCNV的LAMP检测体系通过设计引物,对LAMP体系中镁离子(Mg2+)、dNTPs、甜菜碱等影响因子进行优化,建立了TYLCCNV的LAMP检测体系。并对该LAMP体系的特异性进行了检测,结果显示,烟草曲叶病常见病原如云南烟草曲叶病毒(Tobacco leaf curl Yunnna virus,TbLCYNV)、胜红蓟黄脉病毒(Ageratum yellow vein virus, AYVV)、烟草曲茎病毒(Tobaco curly shoot virus, TbCSV)、中国番木瓜曲叶病毒(Papaya leaf curl China virus, PaLCuCNV)以及阴性对照均呈阴性反应,仅受TYLCCNV侵染的样品检测呈阳性,说明本研究所建立的LAMP检测体系的特异性强。将LAMP技术与普通PCR的检测灵敏度进行比较,结果显示,PCR检测呈阳性的最低DNA模板浓度约为2.098×10-1ng/μL,而LAMP检测最低DNA模板浓度约为2.098×10-3ng/μL,表明LAMP检测体系比普通PCR检测的灵敏度大约强100倍。