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FHL2(four and a half LIM domains protein 2)属于 LIM-Only 蛋白家族中的一员,其作为转录调节子参与基因表达、细胞增殖分化、细胞迁移和凋亡等诸多生理过程,当前研究多集中于人和小鼠。本课题组对连续产多羔和产单羔的绵羊卵巢组织转录组数据分析发现,FHL2在两组中的表达差异显著,推测FHL2对绵羊卵泡发育具有重要调控作用。为证实此推测,本文开展了绵羊不同组织中FHL2基因表达、绵羊卵巢中FHL2基因克隆及生物信息学分析、FHL2基因在绵羊卵巢及颗粒细胞中的表达及定位研究;通过构建FHL2过表达和siRNA干扰两种颗粒细胞模型,研究FHL2对绵羊颗粒细胞生长、类固醇激素分泌及相关基因表达的影响;通过构建绵羊卵巢组织的酵母双杂交CDNA文库,筛选与FHL2互作的宿主蛋白,并进行初步验证。旨在揭示FHL2调控绵羊卵泡发育的分子机制。本研究采用Real-time PCR(RT-PCR)方法检测FHL2基因在绵羊不同组织部位的表达水平;利用分子克隆技术获得绵羊FHL2基因的编码序列,生物信息学分析比较不同物种间序列同源性和进化关系;利用免疫组化技术检测FHL2蛋白在绵羊卵巢组织中的表达分布;采用细胞免疫荧光检测FHL2蛋白在卵巢颗粒细胞中的定位。结果表明:绵羊卵巢中FHL2表达水平高于其它组织,克隆得到的绵羊卵巢FHL2基因CDS为 837bp,编码 279 aa,与GenBank预测序列一致,未发生氨基酸突变,绵羊氨基酸序列与人、牛、猪、马、鸡、狗、猴同源性分别为86%、98.3%、91.7%、89.3%、76.5%、88.2%、86.2%;FHL2主要分布在绵羊卵巢的卵泡(有腔卵泡和无腔卵泡)中,亚细胞定位于卵泡颗粒细胞的细胞质和细胞核中。利用分子克隆技术构建真核过表达载体pcDNA3.1-FHL2,设计合成siRNA 靶向siRNA的干扰序列,转染颗粒细胞后摸索干扰效率,在体外分离培养的绵羊卵巢颗粒细胞中建立超表达和干扰两种卵巢颗粒细胞模型。结果表明:(1)成功构建真核表达载体pcDNA3.1-FHL2,转染至绵羊颗粒细胞后24 h显著提高FHL2的表达;(2)成功合成3条FHL2基因的siRNA,通过RT-PCR和Western Blot检测摸索最佳转染时间和干扰效果,显示siFHL2-2在转染后72 h能够显著降低FHL2的表达。利用AlamarBlueTM HS检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞周期,ELISA方法检测颗粒细胞雌激素和孕酮分泌变化,RT-PCR检测细胞凋亡(Bcl-2,Bax,p53和Caspase3)、细胞周期(CyclinD1,CyclinB1和p21)以及激素分泌(StAR,3β-HSD,CYP11,CYP19)相关基因的mRNA表达水平。结果表明:通过FHL2过表达模型证实:细胞转染后24 h,与对照组相比,FHL2过表达抑制绵羊卵巢颗粒细胞生长(P<0.01);正常细胞比例显著降低(P<0.05),细胞晚期凋亡率升高(P<0.05),检测细胞凋亡相关基因表达水平,Bcl-2表达水平显著下调(P<0.05),Bax和Caspase3表达水平上调(P<0.05),Bcl-2/Bax的比值下调(P<0.01),促进细胞凋亡;细胞周期G0/G1期和S期细胞的比例降低(P<0.001),细胞周期因子Cyclin B1表达水平显著下调(P<0.05);检测生殖激素分泌量及相关基因表达水平,E2和P的分泌量显著降低(P<0.05),CYP19Al、3β-HSD基因表达水平下调(P<0.05)。通过siRNA干扰模型证实:细胞转染后72 h,与对照组相比,干扰FHL2的表达能够促进绵羊卵巢颗粒细胞生长(P<0.01),检测细胞凋亡和凋亡相关基因的表达水平,正常细胞比例升高(P<0.05),细胞晚期凋亡率降低(P<0.05),Caspase3表达水平下调(P<0.05),Bcl-2/Bax的比值上调(P<0.05),抑制细胞凋亡;细胞周期S期和G2/M期细胞的比例升高(P<0.05),细胞周期因子Cyclin D1和p21表达上调(P<0.05);检测生殖激素分泌量及相关基因表达水平,E2分泌量升高(P<0.05),CYP19A1、CYP11A1和StAR基因表达上调(P<0.05)。通过酵母双杂交技术构建绵羊卵巢组织细胞的酵母双杂交文库,构建酵母诱饵质粒pGBKT7-FHL2,利用酵母双杂交文库筛选与FHL2蛋白互作的宿主蛋白。结果表明:成功构建了含有3×108个重组子的绵羊卵巢组织cDNA的酵母双杂交文库,文库滴度为2×107 cfu/mL,以及诱饵载体pGBKT-FHL2,检测诱饵载体无毒性及自激活活性。利用pGBKT7-FHL2诱饵质粒,在酵母文库中筛选出与FHL2互作的蛋白共 1 1 个(RPL31、RPS20、RPS12、COMMD1、AP-1、PLCD1、FOXO1、β-catenin、CREB、NF-κB、CYLD),Blast比对分析发现这些蛋白主要参与蛋白质合成、基因转录、细胞增殖分化、细胞凋亡及信号通路调控等过程。通过添加外源生长因子TGF-β1,研究在卵巢颗粒细胞中对FHL2的表达水平变化。利用TGF-β1蛋白及几个重要信号通路的抑制剂PI3K(Deguelin)、MEK(Combimetinib)、NF-κB(BAY11-7082)、JNK(SP600125)、MAPK(SB202190)处理体外培养的绵羊颗粒细胞,开展FHL2作用信号通路的试验验证。结果表明:外源添加TGF-β1蛋白使FHL2表达水平上调(P<0.05),在此基础上,分别添加上述的信号通路抑制剂,结果显示添加PI3K和MARK信号通路抑制剂,导致FHL2表达水平下调(P<0.05),证实PI3K和MAPK是TGF-β1调控FHL2表达的信号通路。综上所述,绵羊FHL2基因CDS序列全长837 bp,编码279个氨基酸,在卵巢组织中高表达,定位于卵泡颗粒细胞;FHL2影响颗粒细胞的增殖、凋亡、周期和类固醇激素(E2和P)分泌及相关基因表达;筛选获得与其互作蛋白有RPL31、RPS20、RPS12、COMMD1、AP-1、PLCD1、FOXO1、β-catenin、CREB、NF-κB、CYLD共计11个,在绵羊卵泡发育中可能通过互作参与细胞的增殖、凋亡等信号通路过程;PI3K和MAPK是TGF-β1调控FHL2表达的细胞信号通路。