论文部分内容阅读
塞内卡病毒A（Senecavirus A,SVA）,以前称为塞内卡谷病毒（Seneca Valley virus,SVV）,是一种无囊膜的单股正链RNA病毒,分类上属于小RNA病毒科,塞内卡病毒属[1,2]。该病毒是引起猪原发性水疱病的病原之一,成年猪多呈隐性感染,主要引起成年母猪体温升高、口鼻粘膜和蹄部水疱损伤,可导致新生仔猪急性死亡[3-9]。自2015年我国首次爆发该疾病以来[9],该病毒已在全国多个省份扩散,给养猪业的健康发展带来严峻挑战。本实验室分离鉴定获得一株SVA,并进行了以下几个方面的研究:1.塞内卡病毒A的分离与鉴定:本研究采集了疑似SVA感染的猪囊泡液,并用BHK-21细胞培养分离得到一株SVA,该病毒被命名为SVV-CH-SD。电镜观察,该病毒呈二十面体对称,直径为27～30nm。该病毒可在BHK-21、Marc-145、ST、Vero、293T和3D4细胞上增殖。SVV-CH-SD分布于被感染的BHK-21细胞质中,并在感染后20 h时获得最高病毒量。病毒在BHK-21细胞上的噬斑大小约为1.5 mm。SVV-CH-SD毒株的获得将为该病毒的遗传进化、致病机制研究和疫苗的制备奠定重要基础。2.塞内卡病毒A RT-PCR方法的建立与应用:本研究在SVA基因组保守区设计了3对引物,在对特异性、扩增效率筛选后,选出一对最佳引物。通过对扩增条件的一系列优化后,最终确定引物浓度为4 mM/L,最佳扩增条件为:95℃条件下预变性5 min,95℃变性30 s、52℃退火30 s,72℃延伸15 s,35个循环（变性-退火-延伸）,72℃条件下终延伸5 min。结果表明建立的SVART-PCR方法具有较好的特异性及敏感性,其最低检测限为1TCID50。用该方法对山东的100份临床病料进行检测,阳性率为2%。该方法可用于SVA病原的准确快速检测。3.塞内卡病毒A VP1间接ELISA抗体检测方法的建立及应用:用纯化的SVA重组VP1蛋白包被ELISA酶标板,建立间接ELISA抗体检测方法,对其反应条件进行优化,并与血清中和实验（SN）进行敏感性和符合率比较。最终确定最优检测条件:以3 μg/mL浓度包被抗原,包被条件为37℃ 2 h,用5%脱脂奶粉37℃封闭3 h,待检猪血清1:100稀释,血清在37℃条件下孵育1 h,二抗HRP-SPA 1:5000稀释,37℃作用30 min,TMB底物最佳反应时间为37℃作用8 min。采用S/P比值作为判定标准,设定阴、阳性对照,根据公式计算S/P值,如果S/P≥0.278,判为阳性,如果S/P<0.186,则判为阴性。该ELISA方法特异性好,重复性高,与SN方法相比,相对敏感性为98%。用该方法对276份血清进行检测,阳性率为22.1%。该方法是一种快速、简便的血清学诊断方法,用于猪群SVA感染的监测和流行病学的初步调查。4.塞内卡病毒A VP1蛋白单克隆抗体的制备及表位鉴定:本研究采用纯化的SVV CH-SD和重组VP1蛋白免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合和亚克隆,成功获得1株能稳定分泌针对VP1蛋白单抗的杂交瘤细胞株1G9。1G9单抗可特异性识别SVA,其亚型鉴定重链为IgG1型,轻链为Kappa链,单抗表位鉴定其识别的抗原表位为21GELAAP26,并对1G9单抗进行生物学特性研究,包括抗原性、空间结构及保守性分析。该单克隆抗体的研制和抗原表位的揭示将有助于SVA诊断技术的开发及SVA疫苗设计。