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非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)是核质巨DNA病毒,可感染家猪和欧洲野猪等,其发病率和死亡率可达100%。自2018年8月我国出现首例非洲猪瘟(African swine fever,ASF)病例,疫情目前已经蔓延至31个省份或地区,防控形势严峻。ASFV拥有庞大的基因组结构和复杂的免疫逃逸机制,使得该病仍未有商品化疫苗问世。环鸟苷酸-腺苷酸合成酶(Cyclic GMP-AMP synthase,cGAS)是近期发现的DNA胞质模式识别受体,在激活宿主天然免疫、调控适应性免疫中发挥重要作用。cGAS能够识别并结合存在于胞质中DNA,催化合成环化GMP-AMP(cyclic GMP-AMP,cGAMP),后者结合并活化干扰素刺激因子(Stimulator of interferon gene,STING),STING招募TBK1激活IRF3和NF-κB,介导Ⅰ型干扰素和促炎性因子的转录表达。cGAS-STING介导的抗病毒反应是研究热点之一,本文初步筛选具有抑制cGAS-STING信号通路功能的ASFV蛋白并探讨其作用机制,为研发安全有效的ASFV疫苗提供理论支撑。全文研究内容概括如下:1、ASFV Georgia 2007株多基因家族免疫抑制基因筛选:已有研究表明,ASFV部分多基因家族(Multigene family,MGF)蛋白能够抑制I型干扰素表达,拮抗其介导的抗病毒效应。因此我们初步筛选ASFV Georgia 2007的43个MGF基因,发现11个基因抑制cGAS-STING刺激的IFN-β或NF-κB启动子活性。进一步对ASFV-G-ΔMGF缺失的MGF基因功能进行验证,发现免疫抑制基因MGF360-12L、MGF360-13L和MGF505-2R均能抑制PAM和PK-15中IFN-βmRNA水平,其中MGF360-12L抑制作用相对较强。2、MGF360-12L蛋白抑制cGAS-STING介导的抗病毒天然免疫机制研究:试验表明,MGF360-12L能够抑制cGAS/STING刺激的IFN-β和NF-κB启动子活化,能够抑制TBK1或IRF3-5D介导的IFN-β和ISRE启动子激活,并抑制外源性TBK1和IRF3-5D蛋白的表达。此外,MGF360-12L显著抑制由TBK1或IKKβ而非p65过表达诱导的NF-κB启动子活化,抑制外源性TBK1和IKKβ蛋白表达水平和mRNA水平。对JAK-STAT信号通路研究结果表明,MGF360-12L蛋白能抑制IFN-β介导抗病毒效应,促进VSV-GFP的增殖。进一步研究表明,MGF360-12L可通过降低IRF9总蛋白水平抑制IFN-β介导JAK-STAT信号通路。3、DP96R蛋白抑制cGAS-STING介导的抗病毒天然免疫的机制研究:DP96R是ASFV毒力基因之一,但其作用机制仍然未知。本研究中,我们发现DP96R抑制cGAS/STING、TBK1而非IRF3-5D介导IFN-β和ISRE启动子激活,抑制cGAS/STING、TBK1、IKKβ而非p65诱导的NF-κB启动子的活化。此外,DP96R抑制由cGAS-STING共表达刺激的内源性TBK1、IRF3磷酸化水平,抑制外源性TBK1的蛋白表达水平,同时抑制TBK1过表达诱导的抗病毒反应。最后,截短突变分析表明,DP96R C端的30至96位氨基酸是其免疫抑制活性区域。综上,本文初步研究了ASFV MGF360-12L和DP96R蛋白抑制cGAS-STING信号通路的作用机制,为进一步阐明病毒免疫逃逸机制,研发安全有效的ASFV疫苗提供借鉴与参考。