背景和目的: 乳牙牙髓干细胞（stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED）具有来源广泛安全、取材方便、免疫排斥较小等优点，并具有高度的克隆形成能力及多向分化潜能。有实验证明SHED可被诱导分化成多种组织，包括牙本质样结构、骨组织、脂肪组织和神经组织等。SHED还可能具有一定的诱导成骨能力。以上生物学特性使得SHED成为一种极具应用潜力的组织工程种子细胞。 目前，SHED的研究处于起步阶段，特别是国内的报道非常少。本课题旨在探索出一种培养该细胞行之有效的方法，通过对细胞生物学特性的观察、表型分析及体外诱导分化、体内移植实验，明确其干细胞身份，探讨SHED的特点。实验分两部分进行。第一部分内容，首先从健康儿童滞留乳牙中分离培养出SHED，形态学观察、克隆形成率测定、细胞周期分析，应用流式细胞技术和细胞免疫组化方法分析其免疫表型和蛋白表达情况。并于体外诱导培养条件下，观察其矿化和向脂肪细胞分化的能力。实验的第二部分，将SHED与β-磷酸三钙（β-TCP）于体外复合培养，扫描电镜观察细胞与材料贴合的情况，随后将复合材料移植到裸鼠肌肉中继续观察，并在不同时期解剖裸鼠，行大体观察和免疫组织化学切片染色，观察SHED于裸鼠体内的生物学行为，为SHED的进一步研究和利用提供参考依据。 第一部分、SHED的培养和鉴定。 一、方法： 1. SHED的收集和培养。 选取6～10岁健康儿童的滞留乳牙，采用酶消化法培养细胞。拔取牙髓组织，消化、过滤得到细胞悬液，铺瓶培养。 2. 细胞克隆形成实验。 在6孔板中按100个细胞吼的密度接种第2代细胞，培养单克隆细胞群。 3. 细胞形态学观察。 观察原代和传代细胞生长、增殖情况及形态特征，HE染色观察第3代细胞组织学特征。 4. 细胞周期检测。 流式细胞仪检测第2代SHED各时相细胞比例。 5. 流式细胞仪分析细胞膜抗原。 流式细胞仪检测第2代SHED CD90、CD44、STRO-1抗原及第12代细胞STRO-1抗原表达。 6. 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的表达。 分别将第3代和第13代细胞行细胞免疫化学分析，观察bFGF的表达，并比较不同代细胞染色结果差异。 7. 成脂分化诱导实验。 第2代细胞在成脂诱导液条件下培养，观察到脂滴形成后行油红-O染色。 8. 矿化诱导实验。 第2代细胞在矿化诱导液条件下培养，观察细胞出现矿化后终止培养、茜素红染色。 二、结果： 1. SHED的分离和培养。 细胞培养数天后呈克隆样生长，形态呈现多形性，随着传代次数增多，细胞的多形性逐渐减低，并较多呈现出成纤维细胞样形态，胞体变大，颜色变深，大小、形态趋近一致。 2. 细胞克隆形成实验。 克隆形成效率为16～18/103细胞。 3. 细胞HE染色观察。 第3代细胞爬片HE染色：大部分细胞呈短梭形，少量细胞呈多角形，轮廓清。细胞体积小，胞核深染、卵圆形或圆形。胞核体积大，内可见一个或多个核仁。胞浆着色浅。 4. 流式细胞仪检测细胞周期。 第2代细胞周期显示绝大多数细胞处于G0/G1期（73.6%），即静止期及DNA合成前期。G2/M期比例为5.3%，S期细胞比例为21.1%。S期细胞的比例（SPF）较高。 5. 流式细胞仪检测细胞表面抗原。 用第2代细胞CD90、CD44表达率分别为99.1%和99.9%，STRO-1阳性率为25.4%，第12代细胞STRO-1含量仅为1.4%。 6. 免疫组化染色检测bFGF表达。 第3代、第13代细胞爬片免疫组化染色观察可见都表达阳性结果。 7. 体外诱导分化成脂实验。 第2代细胞成脂诱导体系作用下，约15d观察到个别细胞胞浆内出现高强度折射点，20d左右可见串珠样透明高亮度点增多，并有部分融合，油红-O染色呈阳性。 8. 体外诱导矿化实验。 第2代细胞在矿化诱导体系的作用下约第8～9d可以见叠加生长，细胞透光性变差，15d左右部分细胞聚集成散在的片状，28d时结节较多，行茜素红染色后呈阳性。 三、结论： 1. SHED具有很强的增殖力和克隆形成能力。细胞形态学与细胞的种类及分化水平密切相关，可以作为细胞鉴定的参考指标。 2. STRO-1可作为SHED鉴定的抗原之一， CD90、CD44、bFGF对SHED的鉴定没有意义。 3. SHED在体外经诱导具有向脂肪细胞分化的潜能，也可以经诱导发生矿化。 4. 未经纯化的高细胞浓度SHED体外培养可以发生类似矿化样的改变，但不经诱导无法形成钙结节。 第二部分、SHED与β-磷酸三钙复合物在裸鼠体内成骨的初步研究。 一、方法： 1. 细胞原代培养。 同实验第一部分。 2. SHED与β-磷酸三钙（β-TCP）体外复合培养实验。 本课题的实验材料为SHED与β-TCP的复合培养物，对照材料为单纯的β-TCP。将β-TCP颗粒置于96孔板中，共43颗（实验组、对照组各用20颗，另有3颗做扫描电镜观察）。选取第2代SHED消化、计数，分别在23个含有β-TCP颗粒的孔洞内加入2×106个细胞，注满培养基，每12小时换液。在剩余的含β-TCP颗粒的20个孔洞内加纯培养基，作为对照组同期观察。 3. 扫描电镜观察。 在SHED复合β-TCP后的第1、3、5天，分别各取1颗复合培养物，行扫描电镜观察并照相，观察细胞与材料贴附情况。 4. 裸鼠肌袋内移植观察实验。 实验动物分组：20只裸鼠随机分为三组，每组6只，余2只作为实验替补同期观察。每只裸鼠于双侧后腿肌袋分别植入实验材料和对照材料，双侧对照观察。 5. 取材分析。 分别于第2、4、8周解剖裸鼠，观察移植物局部组织毗邻的相互关系。组织块行HE染色，免疫组化检测牙本质涎蛋白（DSP）表达情况。 二、结果： 1. SHED与β-TCP复合培养体的电镜观察。 β-TCP由众多球形材料聚合而成，有均匀分布的孔型，孔壁光滑，细胞在第1天就吸附于材料表面，仍具有典型的多形性形态，可见细胞突起连接、重叠生长等特征。细胞在第5天已经延展成片状，牢固吸附于材料表面。 2. 实验取材和检测。 实验所用20只裸鼠，观察期间死亡4只，另有3只伤口感染。健康的裸鼠分别于第2、4周各解剖5只，第8周解剖3只行大体观察和组织学染色。可见移植物与肌肉组织的紧密贴合，HE染色显示移植材料在第2、4周有大量纤维组织长入，伴有小血管进入，移植材料开始降解。实验组材料到第4周时，仍没有明显的成骨或矿化现象。第8周3只裸鼠的实验组移植物经组织学观察，发现1块含有形态学特征明确的软骨化骨，软骨基质透明，软骨细胞位于基质内陷窝中，细胞核呈椭圆形，陷窝周围有染色较深的软骨囊。另2块移植物内未发现软骨化骨结构。对照组移植物在各期都未发现矿化和成骨现象。所有标本牙本质涎蛋白（DSP）组化染色呈阴性。 三、结论： 1. 在体外，SHED与β-TCP贴合紧密，该材料显示出良好的细胞亲和性。 2. 经大体观察和组织学观察，发现β-TCP在裸鼠体内具有较好组织相容性。 3. SHED移植裸鼠体内，移植物不经诱导可发生软骨化成骨现象，表明SHED直接参与成骨（诱导成骨）的过程可以通过软骨化成骨途径得以实现。