论文部分内容阅读
目的：构建RNA干扰质粒载体抑制烟曲霉菌碱性丝氨酸蛋白酶(ALP)和磷脂酶B(PLB)基因,检测ALP、PLB的表达及酶活性变化并筛选基因沉默菌株；建立鼠ALP、PLB基因沉默烟曲霉菌角膜炎动物模型,观察抑制烟曲霉菌ALP、PLB基因对真菌侵袭及角膜炎症过程的影响；利用醋酸锂转化介导的RNA干扰抑制侵袭性烟曲霉菌ALP、PLB基因,观察其对真菌性角膜炎的实验性治疗作用。方法：(1)分别设计合成针对烟曲霉菌ALP、PLB基因的dsRNA序列,构建质粒载体pALP、pPLB对烟曲霉菌进行RNA干扰,利用RT-PCR、Western-blot等方法分别检测烟曲霉菌ALP、PLB在转录和翻译水平的变化,并利用特殊培养基鉴定其酶活性改变、筛选基因沉默菌株△ALP和△PLB；(2)采用划痕法将△ALP2和△PLB1菌株接种至Wistar大鼠角膜建立ALP、PLB基因沉默烟曲霉菌角膜炎动物模型,利用免疫组织化学染色、实时荧光定量PCR、Western-blot等方法检测角膜组织中角膜组织基质金属蛋白酶2、9(MMP、2MMP-9)表达的变化,并通过组织病理学方法和临床观察检测真菌侵袭及角膜炎症的改变；(3)采用醋酸锂转化法介导pALP2、pPLB1单独或联合对鼠烟曲霉菌角膜炎动物模型进行RNA干扰实验性治疗,采用ELISA检测角膜组织中TNF-α、IL-1β表达的变化,Western-blot检测角膜组织中MMP-9、MMP-2与组织基质金属蛋白酶抑制剂1、2(TIMP-1、TIMP-2)表达比例的变化,并进行组织病理学方法与临床观察,分析RNA干扰实验性治疗的效果。结果：(1)构建的载体质粒经酶切鉴定及测序符合实验设计要求,对烟曲霉菌实施RNA干扰所获基因沉默菌株中,ALP、PLB目的基因mRNA与蛋白表达量均显著低于标准烟曲霉菌株(F=23.77-176.48,P<0.01),其中△ALP2、△PLB1菌株抑制效果较好、酶活性显著低于标准菌株(q=16.082、33.507,P<0.01)。(2)接种烟曲霉菌后1-8天,各组鼠角膜组织中MMP-9 mRNA及蛋白表达显著增高,而MMP-2 mRNA及蛋白表达仅于晚期出现增高。△ALP组、△PLB组角膜组织中MMP-9mRNA及蛋白表达显著低于对照组(P<0.01)；△PLB组角膜组织中MMP-2mRNA及蛋白表达均显著低于对照组(P<0.01),而△ALP组MMP-2 mRNA表达较对照组增高(P<0.01)；组织病理学及临床观察显示△ALP组、△PLB组真菌侵袭、角膜炎症反应明显较轻。(3)对烟曲霉菌角膜炎实验性RNA干扰治疗结果显示,注射后6小时-7天对照组、pBC-hygro组(空质粒载体)角膜组织中TNF-α、IL-1β、MMP-9/TIMP-1均显著增高(P＜0.01), MMP-2/TIMP-2于晚期增高明显(P<O.05),但二者间差异不明显(P>0.05); pALP组、pPLB组、尤其是联合治疗组TNF-α、IL-1β、MMP-9/TIMP-1增高幅度均显著低于对照组(P＜0.01), pPLB组、联合治疗组MMP-2/TIMP-2表达低于对照组,而pALP组MMP-2/TIMP-2则于晚期轻度增高；组织病理学及临床观察显示pALP组、pPLB组尤其是联合组真菌侵袭、角膜炎症反应明显轻于对照组和pBC-hygro组。结论：(1)pALP、pPLB载体质粒构建成功,符合RNA干扰预期设计；(2)RNA干扰可有效抑制烟曲霉菌ALP和PLB的表达,但并不足以完全抑制其酶活性,可能与RNA干扰的效率有关；(3)ALP、PLB通过促进宿主角膜组织中MMP-2、MMP-9的表达,在烟曲霉菌角膜炎发病机制中发挥重要作用；(4)通过载体质粒注射、醋酸锂转化对角膜致病烟曲霉菌实施RNA干扰,单独或联合抑制其ALP、PLB基因表达,可有效减少宿主角膜中前炎症因子释放、调节MMPs/TIMPs表达平衡,抑制真菌性角膜炎的发展,有可能成为治疗角膜真菌感染的新途径。