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通过改变培养条件提高菌株冻干存活率已成为研究热点,但培养条件选择和相关作用机制报道还不够全面。本文以一株植物乳植杆菌LIP-1为例,研究了不同培养条件对菌株冷冻干燥存活率的影响,并利用亚细胞损伤鉴定流程结合生物信息学数据,详细阐述了培养条件改变时菌株生理应答和代谢通路的变化,以探明不同培养条件对菌株冻干存活率影响的内在机制。主要研究成果如下:一、调整缓冲盐成分及初始p H影响菌株冷冻干燥存活率的内在机制1、相比于磷酸氢二钠/柠檬酸缓冲盐体系,在优化培养基中加入0.12 mol/L的乙酸钠/磷酸氢二钾/柠檬酸钠缓冲盐能显著提高菌株冷冻干燥存活率（P＜0.05）。本研究发现这与缓冲盐中的钾离子对细胞膜脂肪酸成分和生物膜的调节有关。钾离子可促进细胞膜脂肪酸调节基因簇中trk A与lys R在转录组水平上调,并促使ACC和FAB家族在转录组和蛋白组水平上调,使细胞膜脂肪酸碳链延长,不饱和脂肪酸合成量提高,以维持细胞膜流动性和致密性,减少细胞膜损伤;同时缓冲盐中的钾离子可促进Lux S/AI-2群体感应系统中lux S基因在转录组水平上调,增加生物膜合成基因cys E的表达量和生物膜的积累量,最终提高了菌株的冷冻干燥存活率。2、相比于初始p H7.4,菌株在初始p H为6.8的条件下生长能显著提高菌株冷冻干燥存活率（P＜0.05）。这与菌株对细胞膜、应激蛋白和表层蛋白的调节有关。初始p H为6.8时,菌株快速生长并产酸,造成的酸胁迫促使柠檬酸裂解酶、ACC家族、FAB家族在转录组和蛋白组水平表达量上调,使环丙烷脂肪酸和不饱和脂肪酸相对含量上升,以维持细胞膜流动性和致密性,减少了细胞膜损伤;同时,酸胁迫导致多个冷应激蛋白表达量上调,提高了菌株抵御冷冻干燥的能力;此外酸胁迫还促使carb,URA4和PYR家族在转录组和蛋白组水平上调表达,加强了谷氨酰胺向尿嘧啶的转化,从而带动UPRT在转录组和蛋白组水平上调表达,使菌株增加表层蛋白积累,增强了细胞壁完整性,最终提高了菌株的冷冻干燥存活率。二、培养基中添加微量物质对菌株冷冻干燥存活率的影响及其内在机制1、氨基酸方面,在MRS培养基中分别加入0.05 mol/L半胱氨酸、0.10 mol/L谷氨酸均能够显著提高菌株冷冻干燥存活率（P＜0.05）。探究其内在机制发现:菌株通过代谢半胱氨酸减少了DNA、细胞膜和细胞壁的损伤,进而提高了菌株的冻干抗性。菌株可将半胱氨酸分解为丙酮酸及NH3,NH3的生成有助于提高胞内p H,减少DNA损伤;同时菌株代谢半胱氨酸生成的谷胱甘肽具有良好的抗氧化性,降低了细胞膜长链不饱和脂肪酸和环丙烷脂肪酸的氧化程度,减少了细胞膜损伤;此外,半胱氨酸的添加能提高srt A基因表达量,增强细胞壁上表面蛋白的锚定作用,使细胞壁完整性增强,最终提高了菌株的冷冻干燥存活率。菌株通过代谢谷氨酸减少了细胞膜和细胞壁损伤,进而提高了菌株的冻干抗性。谷氨酸能使菌株快速生长并产酸,造成的酸胁迫促使膜蛋白调控基因sec G和Dna K的表达量上调,并促进Dna K蛋白在细胞膜上的锚定作用,增强了细胞膜完整性;同时酸胁迫促使细胞膜长链不饱和脂肪酸和环丙烷脂肪酸的相对含量提高,帮助菌株维持细胞膜流动性和致密性,减少了细胞膜损伤;此外,谷氨酸的加入能上调mur L、mur D和van F基因的表达量,从而促进菌株肽聚糖积累,使细胞壁完整性增加,最终提高了菌株的冷冻干燥存活率。2、碱基方面,在MRS培养基中分别加入0.15 mol/L鸟嘌呤和0.70 mol/L胸腺嘧啶均能够显著提高菌株冷冻干燥存活率（P＜0.05）。探究其内在机制发现:菌株通过代谢鸟嘌呤能减少DNA和细胞膜的损伤,并促进生物膜合成,进而提高菌株冻干抗性。菌株代谢鸟嘌呤能为DNA合成提供原料,有助于降低DNA损伤;同时加入鸟嘌呤使菌株快速生长并产酸,酸胁迫促使信号分子pp Gpp合成量增加,进而提高环丙烷脂肪酸基因cfs表达量和环丙烷脂肪酸合成量;同时酸胁迫促使菌株提高不饱和脂肪酸合成量,帮助菌株维持细胞膜流动性和致密性,减少了细胞膜损伤;信号分子pp Gpp的增加,能增强bip A和pga C基因上调表达,促进生物膜积累,最终提高了菌株的冷冻干燥存活率。菌株通过代谢胸腺嘧啶能减少细胞壁、DNA和细胞膜损伤,并促进生物膜合成,进而提高菌株冻干抗性。胸腺嘧啶作为合成肽聚糖的原料,能提高细胞壁的完整性;菌株代谢胸腺嘧啶促进了丝氨酸积累,丝氨酸可进一步分解为丙酮酸和乙酰丝氨酸两个物质。向丙酮酸分解可以促使NH3和ATP的合成,进而提高菌株胞内p H,减少DNA损伤;同时产生的ATP能够促进酰基辅酶A硫酯酶酶活上调,并帮助菌株积累长链不饱和脂肪酸和环丙烷脂肪酸,以维持细胞膜流动性和致密性。丝氨酸向乙酰丝氨酸转化的过程,还提高了cys E基因的表达量和生物膜的积累量,最终提高了菌株的冷冻干燥存活率。本研究解析了不同培养条件对菌株冷冻干燥存活率的影响,在全面探究亚细胞结构损伤的同时结合多组学手段深入探索其中的内在影响机制,揭示了不同培养条件对菌株冷冻干燥抗性的多样化调节,为冷冻干燥乳酸菌的开发和利用奠定了理论基础和数据支持。