目的:本研究联合质谱（MS）、TCR免疫组库测序技术,并结合体外免疫学实验,运用生物信息分析阐明新抗原肽的丰度及其磷酸化修饰与临床免疫效应之间的关系,在此基础上,进一步探索磷酸化修饰对新抗原肽特异性的影响,从而建立一种根据丰度及磷酸化特征快速准确筛选有效新抗原肽的新方法,和提高弱免疫原性抗原肽免疫效应的新技术。方法:1.提取患者癌及癌旁组织蛋白进行HLA-I抗体免疫共沉淀、免疫肽洗脱、分离纯化处理后上样行质谱鉴定,获取相应的质谱检测数据。2.HLA-I限制性抗原肽的筛选:a).首先对带有Thr、Tyr残基的新抗原肽进行后天Thr、Tyr残基单磷酸化或多磷酸化修饰,根据丰度（A＜10~5、B 1x10~5-2x10~5、C＞2x10~5）,即（A低丰度组、B中丰度组、C高丰度组）及磷酸化程度（A非磷酸化肽、B单磷酸化肽、C多磷酸化肽）筛选出相应肽段进入实验。b).从a中筛选出刺激淋巴细胞数达10~6的抗原肽进行深度的TCR免疫组库测序。3.根据新抗原肽的氨基酸序列以及磷酸化修饰位点人工合成新抗原肽及非甲基化Cp G佐剂。4.收集患者外周血标本,体外利用外周血单个核细胞（PBMC）诱导培养出负载新抗原肽的成熟树突状细胞（m DC）,并利用其刺激活化外周血淋巴细胞。5.采用ELISPOT酶联免疫斑点检测量化新抗原肽的免疫原性,同时对体外刺激产生的CTL细胞进行TCR免疫组库测序,定量化检测T淋巴细胞TCRβ链CDR3区,直观反映出磷酸化修饰后T淋巴细胞的功能、免疫应答状态及特异性。结果:1.质谱鉴定共获得727条（源自4例患者）癌组织独有的新抗原肽,根据质谱鉴定结果筛选出癌组织独有的8-11肽,依据肽段丰度及磷酸化水平进一步筛选出54条肽进入实验,通过体外模拟抗原提呈过程成功诱导培养出负载这些新抗原肽的成熟树突状细胞（m DC）,并刺激活化外周血淋巴细胞获得混合淋巴细胞悬液。2.将刺激完成的混合淋巴细胞行酶联免疫斑点（Elispot）计数检测T淋巴细胞活性,设为T值,再将T值进行标准化为T’值,Two-Way ANOVA分析发现高丰度组新抗原肽的免疫效应T’值强于中丰度组及低丰度组（p＜0.05）,且中丰度组的抗原肽免疫效应T’值又强于低丰度组（p＜0.05）;非磷酸化肽的免疫效应T’值均强于单、多磷酸化肽（p＜0.05）,而单磷酸化肽与多磷酸化肽的免疫效应T’值无明显统计学意义（p＞0.05）。3.进一步对36条刺激淋巴细胞数达10~6的抗原肽进行深度的TCR免疫组库测序发现非磷酸化肽组克隆指数明显高于单磷酸化肽组（p＜0.05）和多磷酸化肽组（p＜0.05）,而单磷酸化肽组与多磷酸化肽组的克隆指数无统计学差异（p＞0.05）,结果与ELISPOT结果相符。4.选取其中2组样本（每组分别有3条肽,各组为同一肽自身磷酸化前后对比）进行深度TCRβ链分析发现抗原肽磷酸化修饰后TRBV家族以及TRBV-TRBJ配对有优势取用的丢失和新家族的出现,与此同时,抗原肽磷酸化修饰前后样本间的重叠率极低（＜5%）,但也保留了部分的相似性（＜50%）。结论:1.丰度与新抗原肽免疫原性呈正相关,高丰度（＞2x10~5）抗原肽免疫原性最强。2.任意位点的T/Y磷酸化修饰并未明显增强新抗原肽的免疫效应,反而削弱了其免疫原性。3.抗原肽磷酸化修饰后产生了磷酸肽特异性T淋巴细胞。4.磷酸肽刺激产生的T细胞库与其非磷酸肽刺激产生的T细胞库相比,仍保留了部分（＜50%）的相似性,其中存在一定的交叉反应。5.抗原肽丰度有望成为基于质谱检测的肿瘤表位肽免疫原性的又一关键参数。6.新抗原肽锚定位点磷酸化导致抗原肽构象改变,因而有望成为免疫治疗中有前途的靶点。