论文部分内容阅读
背 景创伤性脊髓损伤(traumatic spinal cord injury,t-SCI)是世界范围内最严重的损伤之一,具有很高的致死率和致残率,严重威胁着人类的生命健康。T-SCI的发病机制复杂,涉及一系列病理、生理和生化改变,概括起来可以分为原发性损伤以及继发性损伤。原发性损伤指的是损伤当时外力对脊髓神经细胞、突起、血管等造成的急性机械性破坏,造成脊髓压迫、挫伤甚至离断,导致血脊髓屏障(blood-spinal cord barrier,BSCB)破坏,脊髓出血、缺血,细胞坏死。继发性损伤是由原发性损伤引发的一系列分子、细胞和生化反应,持续进展贯穿整个t-SCI过程。包括出血性损伤、缺血性损伤、氧化应激损伤、谷氨酸兴奋性毒性、炎症、细胞凋亡、轴突脱髓鞘和变性、细胞外基质(extracellular matrix,ECM)重塑以及胶质增生等。以上这些机制综合作用并相互促进,互为因果,进一步加重脊髓损伤。其中氧化应激损伤是t-SCI的关键机制之一。在氧化应激反应中,活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)过量生成并引起一系列有害效果,包括脂质过氧化、蛋白质氧化和DNA损伤,同时还会激活多条信号通路引发细胞凋亡。神经元凋亡是t-SCI后重要的病理变化,与t-SCI后的神经功能障碍密切相关,抑制神经元凋亡可显著改善t-SCI后的神经功能。DJ-1是一种高度保守并广泛表达的蛋白,在全身多种组织中都有表达,其作用涉及细胞生命活动的多个方面,包括氧化应激,线粒体功能调节,转录调节,蛋白质-RNA相互作用,分子伴侣活性等,其中最重要的作用是抵抗氧化应激损伤。研究表明,DJ-1 在帕金森病(Parkinson’s disease,PD),阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease,AD)以及其他神经退行性疾病及缺血性卒中发挥重要的神经保护作用,而其神经保护效果可能有赖于其抗氧化应激及抗凋亡能力。苯甲酸钠(natrium benzoate,NaB)是一种芳香羧酸的钠盐,具有广泛的药理作用。许多研究表明NaB可通过提高DJ-1的表达而发挥神经保护作用,然而其潜在机制尚不明确。在t-SCI中NaB是否能通过升高DJ-1发挥神经保护作用,其相应机制如何,目前尚无相关研究。本研究旨在探讨NaB调控DJ-1对t-SCI的神经保护作用及机制,为t-SCI治疗提供潜在的药物和可能的作用靶点。方 法第一部分实验1:SD大鼠分为7组,假手术组(sham组),创伤性脊髓损伤后3小时组(t-SCI 3h组),创伤性脊髓损伤后6小时组(t-SCI 6h组),创伤性脊髓损伤后12小时组(t-SCI 12h组),创伤性脊髓损伤后24小时组(t-SCI 24h组),创伤性脊髓损伤后48小时组(t-SCI 48h组),创伤性脊髓损伤后72小时组(t-SCI 72h组)。蛋白免疫印迹(western blot,WB)检测 DJ-1 的表达变化,免疫荧光(immunofluorescence,IF)检测DJ-1和NeuN共染情况,苏木素和伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色观察脊髓显微结构。实验2:SD大鼠分为6组,假手术组(sham组),创伤性脊髓损伤+溶剂组(t-SCI+vehicle组),创伤性脊髓损伤+scramble小干扰RNA组(t-SCI+scramble siRNA组),创伤性脊髓损伤+DJ-1小干扰RNA组(t-SCI+DJ-1 siRNA组),创伤性脊髓损伤+苯甲酸钠组(t-SCI+NaB组),创伤性脊髓损伤+苯甲酸钠+DJ-1小干扰RNA组(t-SCI+NaB+DJ-1 siRNA组)。WB检测DJ-1、Nrf-2、HO-1、SOD2、p-p38 MAPK、Bcl-2、Bax、CC-3、MMP-9、Claudin-5、Occludin及ZO-1 的表达,同时检测ROS水平,干湿重法检测脊髓水含量(spinal cord water content,SCWC),伊文思蓝(evans blue,EB)渗出法检测BSCB破坏情况。实验3:SD大鼠分为3组,假手术组(sham组),创伤性脊髓损伤+溶剂组(t-SCI+vehicle组),创伤性脊髓损伤+苯甲酸钠组(t-SCI+NaB组)。T-SCI+vehicle组和t-SCI+NaB组大鼠术后连续给药7天。于术后第1天、第3天、第7天、第14天、第21天和第28天行BBB(Basso,Beattie,and Bresnahan)评分和斜板试验(inclined plane test,IPT)评分观察大鼠运动功能。第二部分实验1:采用第一部分实验1的动物样品及分组,WB检测p-Akt的表达变化。实验2:采用第一部分实验2的动物样品及分组,WB检测p-Akt的表达。实验3:SD大鼠分为5组,假手术组(sham组),创伤性脊髓损伤+溶剂组(t-SCI+vehicle组),创伤性脊髓损伤+苯甲酸钠组(t-SCI+NaB组),创伤性脊髓损伤+MK2206组(t-SCI+MK2206组),创伤性脊髓损伤+苯甲酸钠+MK2206组(t-SCI+NaB+MK2206 组)。WB 检测 DJ-I、p-Akt、Nrf-2、HO-I、SOD2、p-p38 MAPK、Bcl-2、Bax以及CC-3的表达,同时检测ROS水平。IF检测CC-3、TUNEL和NeuN共染情况,透射电子显微镜(transmission electron microscopy,TEM)观察神经元超微结构。实验4:人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)分为5组,对照组(control组),损伤+溶剂组(injury+vehicle组),损伤+苯甲酸钠组(injury+NaB组),损伤+MK2206组(injury+MK2206 组),损伤+苯甲酸钠+MK2206 组(injury+NaB+MK2206 组)。四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法,台盼蓝(trypan blue,TB)染色法检测细胞活性,WB 检测 DJ-1、p-Akt、Nrf-2、HO-1、SOD2、p-p38 MAPK、Bcl-2、Bax以及CC-3的表达,同时检测ROS水平。结 果第一部分T-SCI后,DJ-1的水平显著升高,24小时达最高峰后逐渐下降。T-SCI后24小时,DJ-1 阳性神经元比例显著升高,DJ-1、Nrf-2、HO-1、SOD2、ROS、p-p38 MAPK和CC-3的水平显著升高,Bcl-2/Bax比值显著降低。DJ-1 siRNA显著降低了 DJ-1及Nrf-2、HO-1、SOD2的水平,升高了 ROS、p-p38 MAPK及CC-3的水平并降低了 Bcl-2/Bax比值。NaB治疗显著升高了 DJ-1及Nrf-2、HO-1、SOD2的水平,降低了 ROS、p-p38 MAPK及CC-3的水平并升高了 Bcl-2/Bax比值,且这些效果可以被DJ-1 siRNA所逆转。T-SCI后24h,SCWC和EB渗出显著升高,MMP-9的水平显著升高,Claudin-5、Occludin和ZO-1的水平显著降低,NaB治疗显著改善了上述情况。T-SCI后,BBB评分和IPT评分显著下降,NaB治疗在t-SCI后21和28天显著提高了上述评分。第二部分T-SCI后,p-Akt的水平显著升高,24小时达最高峰后逐渐下降。T-SCI后24小时,DJ-1 siRNA显著降低了 p-Akt的水平,NaB治疗显著升高了 p-Akt的水平,且这种效果可以被DJ-1 siRNA所逆转。T-SCI后24小时,CC-3和TUNEL 阳性神经元比例显著升高,TEM显示神经元超微结构呈现凋亡改变,线粒体空泡化比例显著升高。NaB治疗显著改善了上述情况,且这些效果效果可以被MK2206所逆转。体外实验发现损伤后细胞活性显著降低。NaB治疗显著改善了上述情况,显著升高了 DJ-1、p-Akt、Nrf-2、HO-1、SOD2 的水平,显著降低了 ROS、p-p38 MAPK和CC-3的水平,显著升高了 Bcl-2/Bax比值,且这些效果效果可以被MK2206所逆转。结 论第一部分NaB治疗可以增加DJ-1及抗氧化蛋白水平,减少ROS及ROS诱导的神经元凋亡,同时还可减轻BSCB破坏和脊髓水肿,并改善长期运动功能。第二部分DJ-1通过促进Akt磷酸化介导其下游抗氧化应激效果,从而减轻氧化应激诱导的神经元凋亡。