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目的：原发性肝癌在我国较常见，占全部恶性肿瘤死亡的18.8％，居第二位。肝癌传统的治疗手段有手术、放射治疗、介入化疗等。手术是治疗原发性肝癌最主要的手段，大多数患者常常因病期晚、肝功能差、病变部位特殊等而丧失手术机会。手术能切除的病例只占全部病例的5％～10％，因此寻找更为有效的治疗手段就非常重要。作为肝癌手术的辅助手段—放化疗，虽然近年取得很大的进步，但疗效仍有限，关键是放化疗可能诱导了肿瘤细胞中的凋亡抑制基因的表达而导致肿瘤细胞对放化疗的抗拒。因此寻求通过基因干扰的手段增加治疗疗效的手段就显得十分重要。目前认为肿瘤的发生是由于控制正常细胞增殖、分化和凋亡的多个基因突变的结果。其中ras基因突变引起的关注较高，原癌基因ras是一种多功能的细胞因子，是人类肿瘤中最常被激活的癌基因，其结构与功能在进化上具有高度的保守性，广泛存在于自然界，在多种细胞生命活动中起极为重要的作用，包括细胞的增殖、分化和细胞骨架的构建。也是人们最先证实与肿瘤发生有关的基因之一。Ras基因家族有3个成员，在人类部分肿瘤中，只要3个Ras基因中有一个基因发生点突变就会引起突变位点上的基因发生改变，这些位点的突变使Ras基因激活，导致P21蛋白的过度生成，持续不断地将信号传入细胞，造成细胞的转化或恶变。1988年顾建人等首次从一例原发性肝癌的基因文库中直接克隆了一株具有很高转化活性的N-ras全基因，进一步说明了N-ras与肝癌的关系。在多种生物细胞中，外源或内源性双链RNA可触发同源mRNA的特异性降解，从而使该基因表达沉默，这种现象称为RNA干扰。因RNA干扰导致的基因沉默发生在转录后水平，也称为转录后基因沉默。RNAi技术具有严格的序列特异性、高效性，基因抑制效果明确、治疗的针对性强、副作用小等优势，已日益发展成为研究基因功能和肿瘤基因治疗的重要工具。相对siRNA来说，单克隆抗体、反义寡核苷酸及其它Ras小分子抑制剂更易产生非特异性副作用，而siRNA诱导的基因沉默显示了显著的特异性，并且能够短时间内沉默目的基因。目前siRNA已经被成功应用在植物和动物细胞中沉默许多基因，而且靶向基因产物表达的降低非常显著，并且RNAi的作用能够遗传给子代细胞。也因此美国斯坦福大学医学院的Andrew Z.Fire和马萨诸塞大学癌症中心Craig C.Mello发现RNA干扰（RNAi）而获2006年度诺贝尔生理学／医学奖。方法常规肿瘤细胞复苏、培养后，细胞爬片采用免疫组化的方法明确选择的肝癌细胞株HepG2和MHCC97-H具有N-Ras基因的突变。根据gene-bank提供的N-Ras序列设计干扰小RNA片断，siRNA转染后在荧光显微镜下确定带有荧光标记的序列是否转染进入肝癌细胞株，通过免疫组化观察RNAi后N-Ras蛋白表达情况的变化，通过western blot和RT-PCR以N-Ras基因与GAPDH基因的吸光度比值表示N-Ras mRNA和N-Ras蛋白表达量，计算RNAi N-Ras基因表达的抑制效率。通过MTT法酶联免疫检测仪570nm处测定各孔吸光度值（A值）检测细胞生长曲线的变化和肿瘤细胞生长的抑制率。运用流式细胞仪检测RNAi后肝癌细胞株的细胞周期变化和细胞凋亡情况。最后通过对照研究RNAi前后两株肝癌细胞不同剂量照射后肿瘤细胞集落形成率，利用Graphpad prism 4.0软件拟和线性二次曲线模型和单击多靶模型，得到放射生物学参数，明确RNAi N-Ras基因是否具有增加放射敏感性的变化。结果1人肝癌细胞株HepG2和MHCC97-H免疫组化显示Ras蛋白表达呈强阳性，说明选择的肝癌细胞株具有Ras基因突变。2转染效率，按发绿色荧光细胞数占总细胞数的百分率计算，MHCC97-H细胞平均转染效率为91％，hepG2细胞的平均转染效率为93％。3 RT-PCR HepG2细胞和MHCC97-H细胞RNAi后的PCR产物电泳带密度较干扰前明显减弱，HepG2细胞RNAi后N-Ras mRNA表达抑制率为61.3±3.351％，空白质粒组为1.93±0.346％，有显著性差异；MHCC97-H细胞RNAi后N-Ras mRNA表达抑制率为96.9±0.159％，空白质粒组为4.6±0.2.811％，有显著性差异。4 western blot HepG2细胞和MHCC97-H细胞RNAi后N-Ras蛋白电泳密度明显减低，Ras蛋白的表达抑制率63.7±0.041％，空白质粒组为2.2±0.007％。有显著性差异；MHCC97-HRNAi后N-Ras蛋白的表达抑制率89.8±0.012％，空白质粒组为2.3±0.005％。有显著性差异。5 HepG2细胞RNAi后免疫组化检测仍有40％左右N-Ras蛋白表达。MHCC97-H细胞RNAi后免疫组化检测未见N-Ras表达。6 MTT所测的MHCC97-H细胞干扰前后生长曲线显示RNAi后细胞增殖速度减慢，细胞生长受到抑制，与未RNAi细胞之间从第1天开始差别有统计学意义（P＜0.05），此后差别越来越显著。MTT所测的HepG2细胞干扰前后生长曲线显示实验组细胞增殖速度减慢，细胞生长受到抑制，与对照组之间从第3天开始差别有统计学意义（P＜0.05），此后差别越来越显著。7 MHCC97-H细胞和HepG2细胞生长RNAi后生长抑制率分别为：21.9％，23.8％。8流式细胞仪检测MHCC97-H细胞和HepG2细胞RNAi后出现G1阻滞，有统计学差异，凋亡RNAi前增多。9 MHCC97-H细胞和HepG2细胞生长RNAi后不同剂量照射后，MHCC97-H细胞干扰前后D0值分别为：3.00±0.077，3.34±0.015：HepG2细胞干扰前后分别为：2.38±0.05，2.33±0.10。MHCC97-H细胞干扰前后Dq值分别为：2.89±0.042，1.83±0.22：HepG2细胞干扰前后分别为：2.88±0.087，2.28±0.018。Dq值均较前减小。且有显著性差异。MHCC97-H细胞干扰前后SF2值分别为：0.817±0.01，0.716±.013；HepG2细胞干扰前后分别为：0.824±0.001，0.742±0.020。两株肝癌细胞RNAi前后SF2具有显著性差异。MHCC97-H细胞RNA干扰前后增敏此SER=1.15，HepG2细胞RNA干扰前后增敏比SER=1.10。MHCC97-H细胞干扰前后α／β值分别为：4.21±1.536，9.837±2.234：HepG2细胞干扰前后分别为：0.938±0.132，2.98±1.232。HepG2细胞RNAi后的α／β值较前有显著性差异。结论：1．原发性肝癌的发生、发展中癌基因N-Ras基因突变具有十分重要的作用。2．本研究所构建的N-Ras基因的siRNA可以有效、特异地阻断N-Ras基因的表达，阻断N-Ras基因可以改变细胞周期的分布G1阻滞，诱导凋亡增加。不同状态P53基因的肝癌细胞生长速度明显减慢。3．本研究首次运用RNAi技术研究两株不同状态的p53基因的肝癌细胞株的放射敏感性，研究表明RNAi N-Ras基因可以改变肝癌细胞株的各个放射生物学参数，达到放射增敏的目的。