本文从以下几个部分展开论述：　　第一部分 NSCLC患者血浆中C5a含量和癌组织中增生相关基因表达的检查以及KLF5、GCN5、GDF15和C5aR表达水平与患者临床病理学资料的相关性分析　　目的：测定非小细胞肺癌（non-smallcell lung cancer，NSCLC）患者及正常人血浆中C5a的含量及其NSCLC新鲜癌组织和癌旁组织基因表达谱的变化，并验证转录因子KLF5、转录辅激活因子GCN5和生长分化因子GDF15在NSCLC新鲜和石蜡包埋的癌组织及癌旁组织中的表达情况。同时，检查NSCLC患者癌组织中C5a受体（C5aR）的表达水平。此外，分析KLF5、GCN5、GDF15和C5aR的表达与NSCLC患者临床病理特征之间的相关性。　　方法：用ELISA法检测NSCLC患者及正常人血浆中C5a的含量。另收集NSCLC患者癌组织和癌旁组织的新鲜和石蜡包埋标本及其相关的临床病理学资料。行高通量测序并分析NSCLC及癌旁组织转录组，找出差异表达的基因。扩大样本量后用RT-qPCR验证测序结果，且筛选升高显著的基因（即KLF5、GCN5和GDF15），并进一步用免疫组化（IHC）染色检查KLF5、GCN5和GDF15的表达水平。　　结果：（1）40例NSCLC患者血浆中C5a的含量明显高于正常人血浆中的C5a含量，差异具有统计学意义。（2）12例NSCLC组织及癌旁组织（分为三组）转录组高通量测序结果表明，相比与癌旁组织，三组癌组织中共同上调2倍以上的基因有86个。GO分析发现，其中涉及细胞增生和存活的基因占17.4%。（3）RT-qPCR测定部分增生相关基因（即KLF5、HMGA1、FOXM1、EHF、HMGB3、SOX4、SOX9、GCN5、GDF15、MDK、TDGF1和cyclin D1）的mRNA水平显示，这些基因在40例NSCLC患者癌组织中，其mRNA的水平均明显高于癌旁组织，尤以KLF5、GCN5和GDF15升高的最为显著，且这三种基因的mRNA升高还存在正相关关系。（4）IHC检查KLF5、GCN5和GDF15蛋白的表达发现，该三种蛋白在185例NSCLC患者癌组织石蜡标本中的表达水平和阳性表达率均明显高于癌旁组织，且其表达程度还与NSCLC肿瘤大小、淋巴结浸润和肿瘤的TNM分期密切相关。（5）185例NSCLC患者癌组织中C5aR的表达也明显高于癌旁组织，并也与肿瘤的大小、淋巴结浸润和TNM分期相关。　　结论：（1）NSCLC患者血浆中C5a的浓度显著升高。提示NSCLC患者体内存在补体系统的激活，且其肿瘤微环境中可能存在C5a。（2）NSCLC患者癌组织中存在基因表达谱的变化，检查的增生相关基因中，以KLF5、GCN5和GDF15的升高较为显著，且这三种基因的mRNA水平还呈正相关关系。（3）NSCLC患者癌组织中KLF5、GCN5和GDF15以及C5aR的表达水平与患者肿瘤的大小、淋巴结浸润以及TNM分期密切相关。提示，这些基因的表达升高可能与NSCLC的发生与发展有一定的联系。　　第二部分 C5a刺激诱导A549细胞增生和上调KLF5、GCN5、GDF15表达的作用以及KLF5与GCN5调控细胞增生和GDF15基因转录与表达的分子机制　　目的：体外探讨C5a刺激NSCLC细胞诱导其细胞增生及KLF5、GCN5、GDF15基因表达的作用，并研究KLF5、GCN5促进C5a诱导细胞增生的效应及其启动GDF15基因转录与表达的分子机制。　　方法：（1）用免疫印迹(IB)实验检查NSCLC六种细胞系中C5aR的表达，再选定A549细胞用定量的人重组C5a刺激细胞不同时间，行CCK8、细胞计数及克隆形成实验检查A549细胞的增生及其KLF5、GCN5和GDF15基因的转录与表达水平。同时行相同的方法测定用C5aR拮抗剂阻断C5aR及用C5a抗体中和C5a后细胞增生及前述基因的表达情况。（2）用分子克隆的方法构建KLF5、GCN5和GDF15真核表达质粒和发夹状小干扰（shRNA）表达质粒，转染上述质粒至A549细胞中，观察过表达或沉默这3个基因（沉默后再给予C5a刺激），用前述相同方法检查A549细胞的增生及其KLF5、GCN5和GDF15的表达。同时用IB检查3种基因中某一基因表达变化对其他两种基因表达的影响。（3）用JASPAR预测KLF5在GDF15基因启动子上的结合反应元件（response element，RE1~RE5），并用分子克隆的方法构建GDF15基因启动子全长和4个截短启动子质粒，转染A549细胞后行C5a刺激或与其他质粒共转染A549细胞，通过荧光素酶报告实验检查C5a刺激、过表达和沉默KLF5基因后GDF15基因启动子的活性，并初步筛查KLF5与GDF15启动子结合的部位。　　结果：（1）NSCLC六种细胞系均能表达C5aR，但以A549细胞和PC9细胞表达的最为显著，故选择A549细胞和PC9细胞用不同剂量的C5a刺激后发现，不仅细胞的增生以A549细胞较为明显，而且用C5a刺激后3h，KLF5、GCN5和GDF15的基因表达水平也明显上调。（2）阻断C5aR和中和C5a刺激后，A549细胞的增生和前述3种基因的表达量均显著下调。（3）过表达或沉默这3种基因后再行C5a刺激，A549细胞的增生明显增多或显著减少。　　结论：C5a刺激可经结合C5aR诱导A549细胞增生，其促增生的机制涉及由C5a上调的KLF5与GCN5结合形成复合物共同结合到靶基因GDF15的启动子上，进而促进了GDF15基因的转录与表达。　　第三部分 GCN5结合及乙酰化修饰KLF5对C5a刺激A549细胞诱导细胞增生和促进GDF15基因启动、转录与表达的影响　　目的：探讨在C5a刺激A549细胞诱导其增生的过程中，转录因子KLF5与转录辅激活因子GCN5结合并被GCN5乙酰化修饰后对A549细胞增生和GDF15基因启动、转录和表达的影响。与此同时，鉴定KLF5被GCN5乙酰化修饰的位点，并研究GCN5催化结构域突变和KLF5乙酰化修饰位点突变对C5a诱导细胞增生和启动GDF15基因转录与表达的影响。　　方法：（1）利用免疫沉淀（IP）和IB实验检查C5a刺激A549细胞和阻断C5aR或中和C5a后，KLF5与GCN5的结合情况及其KLF5的乙酰化修饰水平。然后，用前述相同的方法观察过表达或沉默GCN5基因或细胞转染GCN5乙酰化酶催化结构域缺失突变质粒（△GCN5）后再给予C5a刺激，KLF5与GCN5的结合以及KLF5的乙酰化修饰情况。（2）用分子克隆的方法构建FLAG-KLF5表达质粒，与GCN5共转染A549细胞获取纯化的KLF5蛋白行质谱分析，检查KLF5被GCN5乙酰化修饰的位点。　　结果：（1）C5a刺激A549细胞后2h，GCN5与KLF5的结合已明显增多，3h到达高峰，且KLF5的乙酰化水平也同步升高。阻断细胞上的C5aR和中和C5a后，GCN5与KLF5的结合及KLF5的乙酰化水平均显著下降。（2）在A549细胞内过表达GCN5或沉默GCN5基因后再行C5a刺激，GCN5与KLF5的结合及其KLF5的乙酰化水平随之呈现明显的升高或降低。　　结论：GCN5作为一个兼有组蛋白乙酰化酶（HAT）活性的转录辅激活因子，在C5a刺激A549细胞诱导增生的过程中，能与转录因子KLF5结合并乙酰化修饰KLF5,而被乙酰化修饰的KLF5能充分地与其下游靶基因GDF15的启动子结合，并促进其基因转录与表达，最终导致了A549细胞的增生。　　第四部分 沉默A549细胞中的KLF5、GCN5和GDF15基因对其接种裸鼠形成皮下移植瘤的生长及增生相关指标表达的影响　　目的：体内验证沉默A549细胞中的KLF5、GCN5和GDF15基因后对其接种裸鼠所形成皮下移植瘤生长的影响，并探讨这些移植瘤中KLF5、GCN5和GDF15基因的表达、KLF5乙酰化修饰水平以及细胞增生相关蛋白（cyclin D1、PCNA和Ki67）表达的变化。　　方法：（1）构建慢病毒（LV）包装的LV-shKLF5、LV-shGCN5、LV-shGDF15和LV-shCTR表达载体。用IB检查稳转上述载体后的A549细胞中KLF5、GCN5和GDF15的表达水平。（2）将前述四种LV-shRNAs分别处理的A549细胞接种裸鼠腋窝皮下（每组8只），建立裸鼠皮下肺腺癌移植瘤模型，定期检查四组裸鼠皮下移植瘤的生长情况、体积大小与重量。　　结果:（1）构建的LV-shKLF5、LV-shGCN5和LV-shGDF15稳转A549细胞后能明显下调由C5a刺激诱导的相应蛋白的表达。（2）皮下接种LV-shKLF5、LV-shGCN5和LV-shGDF15处理A549细胞的裸鼠，其移植瘤的生长体积、肿瘤大小与重量均显著低于相应的对照组（LV-shCTR）。　　结论：沉默了KLF5、GCN5和GDF15基因的A549细胞在裸鼠皮下形成的移植瘤，其生长速度和瘤细胞的增生均显著下调。表明，KLF5、GCN5和GDF15对NSCLC的生长有促进作用。而在此过程中，GDF15基因的表达确实受KLF5和GCN5的调控，且GCN5能够乙酰化修饰KLF5，进而促进GDF15基因的表达。