研究目的和背景骨质疏松症是骨科临床最为常见的疾病之一,老年人群尤其常见,骨质疏松引起的各种骨折严重影响老年人的生活质量。鉴于全球人类的预期寿命逐渐增加,骨质疏松症的发病率也大大提升,并给大多数国家造成沉重的经济负担。研究表明骨骼形成过程和骨骼吸收过程的不平衡是骨质疏松症的根本原因,即骨的分解代谢超过了骨的合成代谢。骨稳态的动态平衡是一个牵涉大量分子调节和细胞调控的生物学行为,虽然现有的研究还不能完整的确定骨质疏松症详尽的发病机制,但焦点还是在于探究成骨细胞（OBs）和破骨细胞（OCs）之间的协调及交互作用,并初步证实了破骨细胞的异常激活会导致骨代谢平衡破坏,最终引起骨折疏松。有研究表明NO/鸟苷酸环化酶（GC）/环磷酸鸟苷（c GMP）信号通路在调节骨代谢方面有着重要的作用,并且鸟苷酸环化酶在骨代谢中扮演关键的角色,它主要是通过NO/c GMP/PKG信号诱导成骨细胞的增殖和分化。类似的动物实验也表明可溶性GC（s GC）激活剂能够提高卵巢切除小鼠的血清c GMP浓度,缓解卵巢切除诱导的骨质疏松。另一方面,研发有效的抗骨质疏松药物特别是针对破骨细胞异常活化的药物迫在眉睫。新型口服可溶性鸟苷酸环化酶（s GC）激动剂Vericiguat于2020年首次报道用于治疗心力衰竭患者,并证实了临床使用的安全性,基于之前的鸟苷酸环化酶激动剂虽然在实验室取得了理想的抗骨质疏松效果,但是在临床实验中却出现了严重的不良反应,因此未能上市。那么已经上市的Vericiguat是否能够影响骨细胞的代谢,能否具有抗骨质疏松的作用,还需要进一步的实验研究。本课题首先应用新型鸟苷酸环化酶激动剂Vericiguat在体外作用于小鼠破骨细胞,探索Vericiguat对于巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和核因子κ-B配体受体激活剂（RANKL）诱导的小鼠破骨细胞分化和激活的作用及其分子生物学机制。其次,构建卵巢切除的小鼠骨质疏松模型,将Vericiguat作用于此类模型小鼠并观察其干预结果,并探讨可能的作用机制。为开发新的抗骨质疏松药物奠定理论基础。第一部分:Vericiguat对体外破骨前体细胞增殖活性的影响方法:1.从实验小鼠四肢长骨骨髓腔中提取骨髓来源的单核巨噬细胞（BMMs）进行培养和分化,并对成熟破骨细胞进行鉴定。2.用不同浓度的s GC激动剂Vericiguat处理小鼠骨髓来源的单核巨噬细胞,并使用CCK8试剂盒观察细胞的存活情况。3.蛋白免疫印迹法检测不同浓度Vericiguat处理后骨髓来源的单核巨噬细胞凋亡标记物表达情况。结果:1.研究者体外成功获得小鼠原代骨髓来源的单核巨噬细胞,并能够成功的分化为成熟的破骨细胞。2.浓度在8μmol/L及以下的Vericiguat对于骨髓源性单核巨噬细胞并无毒性。结论:8μmol/L及以下浓度的Vericiguat对于骨髓源性单核巨噬细胞无明显细胞毒性,也不会抑制细胞的增殖,表明适宜浓度的Vericiguat可安全的用于调控破骨细胞分化以及探究分化过程中的机制,为后续的实验奠定了基础。第二部分:Vericiguat对体外破骨细胞分化的双向作用及其分子机制研究方法:1.应用TRAP染色的方法观察不同浓度的Vericiguat对于M-CSF和RANKL介导的破骨细胞分化的影响。2.应用鬼笔环肽染色、DAPI染色和康宁骨分析表面多孔板检测骨吸收活性实验观察不同浓度的Vericiguat对于M-CSF和RANKL介导的成熟破骨细胞功能的影响。3.蛋白免疫印迹法和逆转录定量PCR法观察不同浓度的Vericiguat对于M-CSF和RANKL介导的破骨细胞分化关键基因表达的影响。4.蛋白免疫印迹法和逆转录定量PCR法观察不同浓度的Vericiguat作用破骨前体细胞后细胞分化相关信号通路的表达结果。5.通过si RNA来沉默破骨前体细胞中血管扩张刺激磷蛋白（VASP）的表达,观察VASP在体外破骨细胞分化中的作用,以及VASP在Vericiguat干预破骨细胞分化中的作用。6.通过分子生物学实验方法和计算机分子模拟实验确定Vericiguat调控破骨细胞形成和分化的机制。结果:1.低浓度Vericiguat干预组的成熟破骨细胞数量和面积均明显增加,但是随着Vericiguat干预浓度的增加,成熟破骨细胞数量和面积却逐渐减少。2.低浓度Vericiguat干预后F-肌动蛋白环的数量和面积均明显增加,高浓度Vericiguat干预后F-肌动蛋白环的数量和面积均明显减少。康宁骨分析表面多孔板实验验证成熟破骨细胞吸收功能差异的趋势也与此一致。3.破骨细胞分化中特异性信使RNA的表达水平在低浓度Vericiguat组具有不同程度的上升,的,在高浓度Vericiguat干预组是减弱的。4.正常体外破骨细胞分化过程中MAPK信号通路,NF-κB信号通路,AKT信号通路都是激活的。而Vericiguat对破骨细胞分化的调控作用和NF-κB信号通路直接相关。5.成熟的破骨细胞高表达VASP,但si RNA沉默其表达后,破骨细胞相关基因的表达降低。Vericiguat对p-p65和破骨细胞相关基因表达的促进作用可以被敲除VASP而阻断。6.低浓度Vericiguat通过VASP/NF-κB信号通路促进破骨细胞的分化。分子模拟实验证实高浓度Vericiguat直接干扰NF-κB信号通路的激活。在高浓度组表达是下降的,Western Blot法对细胞分化特征蛋白进行了检验,结果与信使RNA的表达趋势完全一致。此外RANKL刺激的NFATc1核转位具有时间依赖的特点,并且NFATc1核转位在低浓度Vericiguat干预组是增强结论:1.这部分研究中首先证实了Veirciguat对M-CSF和RANKL诱导的破骨细胞分化融合和骨吸收活性存在浓度依赖的双重效应。首先M-CSF和RANKL诱导的BMMs细胞向破骨细胞的分化可以被低浓度的Veirciguat所激活,同时还证实了其具有促进骨吸收的作用。而高浓度的Veirciguat作用则完全相反。2.Veirciguat对于破骨细胞的双重调节作用从分子层面的分析来说,是通过IκB-α/NF-κB信号通路的双向激活来实现的,而IκB-α/NF-κB信号通路与s GC/c GMP/VASP通路之间可能也存在动态平衡。最后得出Vericiguat是通过调节VASP/NF-κB信号通路的活化来双向干预破骨细胞的分化。第三部分:Verciguat对卵巢切除诱导的小鼠骨丢失的治疗效果方法:通过卵巢切除（Ovariectomy,OVX）建立骨质疏松小鼠模型,然后用不同浓度的Vericiguat干预实验小鼠,最后采用Mirco-CT定量检测以及组织切片染色分析,从而明确Vericiguat对于卵巢切除诱导的骨质疏松的体内治疗效果。结果:1.小鼠卵巢切除导致的骨质疏松模型成功建立。2.Mirco-CT检查结果显示Vericiguat干预后的松质骨参数及皮质骨参数均高于OVX对照组。骨组织切片染色后观察亦可见Vericiguat干预后破骨细胞的数量较OVX对照组有所下降,而且高浓度Vericiguat干预组的抗骨质疏松作用更强。结论:Vericiguat可在OVX小鼠中发挥抗骨质疏松作用,无论浓度高低。小结本课题首先证实体外环境下Vericiguat在8μmol/L浓度以下对于骨髓源单核巨噬细胞无明显细胞毒性,进一步的实验证明了低浓度Vericiguat可以促进M-CSF和RANKL诱导的BMMs向破骨细胞的的分化和成熟,而高浓度Vericiguat则抑制BMMs向破骨细胞的分化。其次,低浓度的Vericiguat激活破骨细胞分化作用可能归因于VASP/NF-κB信号通路的激活,而高浓度的Vericiguat可直接抑制NF-κB信号通路进而抑制破骨细胞的形成和分化。最后,通过卵巢切除构建的骨质丢失小鼠模型证实了Vericiguat可以在体内逆转雌激素缺乏引起的骨质疏松。总而言之,我们的研究表明Vericiguat可以浓度依赖的调节体内和体外的破骨细胞分化,并且Vericiguat可以潜在地用于治疗雌激素缺乏所致的骨质疏松。