论文部分内容阅读
非洲猪瘟(Africa swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(Africa swine fever virus,ASFV)引起家猪和野猪的一种急性、热性和高传染性的疾病。自1921年首次发现非洲猪瘟疫情,该病已在全球数十个国家流行。2018年8月1日,我国辽宁省沈阳市首次报道ASF疫情,经基因进化树分析发现该毒株属于基因II型,与Georgia 2007/1毒株属于一个进化分支。当前疫情已在河南、江苏、浙江、安徽、黑龙江、内蒙古、吉林、天津、香港等32个省/直辖市/特别行政区蔓延流行,造成极大经济损失,我国生猪业也面临严峻考验。非洲猪瘟病毒基因组中约30%开放阅读框存在多个拷贝,即多基因家族(Multigene families,MGFs)。实验室前期研究表明,MGF360家族成员12L、13L、14L可能抑制IFN所介导的天然免疫应答,是基因缺失疫苗研制的主要靶标之一,因此针对抑制基因建立快速准确的检测方法非常重要。研究首先根据ASFV Georgia 2007/1分离株参考序列合成MGF360-12L、-13L、-14L基因,并克隆至pcDNA3.1真核载体,将重组质粒转染至PK15及293T细胞,通过荧光定量PCR检测基因对IFN-β(Interferon-β)表达的抑制作用,发现12L、13L的抑制作用较强。随后以pcDNA3.1-12L、-13L重组载体为模板,分别设计4组引物,选取特异性引物进行重组酶聚合酶(RPA)检测方法的初步建立。结果表明,所建立的12L基础RPA方法可在35℃、30 min时实现对目的片段的稳定扩增,而13L-RPA可在39℃恒温反应20 min完成扩增;该方法的敏感性可分别达到10~3和10~2个拷贝,同普通PCR方法检测限一致;此外,该RPA方法仅特异性扩增ASFV MGF360的12L或13L基因,对PEDV、FMDV、CSFV、PRRSV、PRV和PCV-2基因组没有扩增。使用ASFV基因组为阳性样品进行扩增发现,将基因组稀释后,12L-RPA、13L-RPA仍能检测到目的基因的存在,表明该检测方法具有一定的临床价值。分别选择pGEX6p-1、pET-21a、pET-28a、pET-32a大肠杆菌原核表达载体进行免疫抑制蛋白12L和13L的表达。表达条件经优化后,表达产物均为包涵体形式,实验发现以pET-21a为载体表达的包涵体蛋白溶解效果最好,纯化后的蛋白浓度可达200-500μg/mL。综上,研究基于ASFV MGF360-12L、-13L基因序列,初步建立了RPA检测方法,可对病毒MGF360-12L、-13L基因实现快速、特异性扩增,为后续12L、13L基因缺失疫苗的鉴别诊断提供一定的技术支持。同时克隆表达并成功纯化12L、13L蛋白,为后续多克隆抗体的制备、间接ELISA检测方法的建立及相关蛋白的功能研究进行了前期储备。