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β-半乳糖苷酶属于外切糖苷酶，能够将半乳糖基从糖复合物的非还原性末端切割下来，释放出游离半乳糖，是用于糖链结构解析的一种重要工具酶。现有的伊半乳糖苷酶来源不够广泛且缺乏足够的底物特异性，不能满足糖生物学的发展需要，因此需要寻找新的具有特殊功能的半乳糖苷酶。Akkermansia muciniphila是来自人体肠道黏膜的革兰氏阴性严格厌氧菌，以前的研究中还没有关于该菌能够表达伊半乳糖苷酶的报道。
本研究利用生物信息学技术，从Akkermansia muciniphila源中挖掘出一种新型的伊半乳糖苷酶基因，对其进行基因克隆、表达载体的构建以及体外重组表达后获得了重组伊半乳糖苷酶基因，并对其酶学特性和底物特异性进行了研究。
1.以Akkermansia muciniphila源的基因组DNA为模板，克隆，获得编码伊半乳糖苷酶的基因AmBGal0874。通过重组质粒及表达载体的构建等步骤将克隆完成得到的重组伊半乳糖苷酶基因转到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，然后通过镍亲和层析柱对重组伊半乳糖苷酶进行纯化。利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对重组酶的表达和纯化效果进行检测，并利用底物4-甲基伞形酮移半乳糖(4MU-β-Gal)显色反应对酶活性进行检测，结果表明获得了纯度较高且具有活性的重组伊半乳糖苷酶。
2.为了确定重组伊半乳糖苷酶的活性及底物特异性，用酶标仪方法检测10种不同的经pNP衍生得到的糖底物(pNP-α/β-半乳糖，pNP-α/β-岩藻糖，pNP-α/β-甘露糖，pNP-α/β-葡萄糖，pNP-α/β-N-乙酰葡糖胺)，结果表明重组伊半乳糖苷酶只能水解pNP-β-半乳糖，对pNP-β-半乳糖具有专一性。而酶的生化特性研究表明:酶AmBGal0874的最适温度为45℃;最适pH为3.5;不依赖金属离子，镁离子能够降低酶的活性，其它的金属离子和EDTA对酶活性没有抑制作用;SDS对酶活性抑制作用最强，几乎0.1％(V/V)的SDS就使酶几乎完全失活，而其它表面活性剂对酶活性几乎没有抑制作用。酶的比活力为83.33mU/mg，Km值为1.73mM，最大反应速率为0.54μmol/min/mg。
3.利用不同连接键型的O-链及N-链寡糖标品对重组伊半乳糖苷酶的底物特异性进行检测。结果表明:酶AmBGal0874能够水解各种底物非还原性末端的β1，3-和β1，6-连接的半乳糖，对β1，4-键连接的半乳糖的水解效率极低甚至可以忽略不计。对于连接键型相同但相邻糖分子不同的底物的水解效率也有很大差别，说明部分糖苷配体的不同也会极大影响酶对其的水解活性。
综上所述，本研究成功克隆了Akkermansia muciniphila源的新型卢.半乳糖苷酶基因并在大肠杆菌中实现了异源重组表达。它是第一个从人体肠道黏膜中分离出来并被定性的酶。该酶具有较强的温度耐受性且反应的pH环境偏酸性，扩大了应用条件范围，丰富了β-半乳糖苷酶基因的研究库。同时，该伊半乳糖苷酶具有强大的水解能力和特殊的底物连接位点以及键型特异性，能够高效水解各种寡糖底物非还原性末端的β1，3-和β1，6-连接的半乳糖，为糖生物学研究提供了一种重要的工具酶，具有极大的潜在利用价值。
本研究利用生物信息学技术，从Akkermansia muciniphila源中挖掘出一种新型的伊半乳糖苷酶基因，对其进行基因克隆、表达载体的构建以及体外重组表达后获得了重组伊半乳糖苷酶基因，并对其酶学特性和底物特异性进行了研究。
1.以Akkermansia muciniphila源的基因组DNA为模板，克隆，获得编码伊半乳糖苷酶的基因AmBGal0874。通过重组质粒及表达载体的构建等步骤将克隆完成得到的重组伊半乳糖苷酶基因转到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，然后通过镍亲和层析柱对重组伊半乳糖苷酶进行纯化。利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对重组酶的表达和纯化效果进行检测，并利用底物4-甲基伞形酮移半乳糖(4MU-β-Gal)显色反应对酶活性进行检测，结果表明获得了纯度较高且具有活性的重组伊半乳糖苷酶。
2.为了确定重组伊半乳糖苷酶的活性及底物特异性，用酶标仪方法检测10种不同的经pNP衍生得到的糖底物(pNP-α/β-半乳糖，pNP-α/β-岩藻糖，pNP-α/β-甘露糖，pNP-α/β-葡萄糖，pNP-α/β-N-乙酰葡糖胺)，结果表明重组伊半乳糖苷酶只能水解pNP-β-半乳糖，对pNP-β-半乳糖具有专一性。而酶的生化特性研究表明:酶AmBGal0874的最适温度为45℃;最适pH为3.5;不依赖金属离子，镁离子能够降低酶的活性，其它的金属离子和EDTA对酶活性没有抑制作用;SDS对酶活性抑制作用最强，几乎0.1％(V/V)的SDS就使酶几乎完全失活，而其它表面活性剂对酶活性几乎没有抑制作用。酶的比活力为83.33mU/mg，Km值为1.73mM，最大反应速率为0.54μmol/min/mg。
3.利用不同连接键型的O-链及N-链寡糖标品对重组伊半乳糖苷酶的底物特异性进行检测。结果表明:酶AmBGal0874能够水解各种底物非还原性末端的β1，3-和β1，6-连接的半乳糖，对β1，4-键连接的半乳糖的水解效率极低甚至可以忽略不计。对于连接键型相同但相邻糖分子不同的底物的水解效率也有很大差别，说明部分糖苷配体的不同也会极大影响酶对其的水解活性。
综上所述，本研究成功克隆了Akkermansia muciniphila源的新型卢.半乳糖苷酶基因并在大肠杆菌中实现了异源重组表达。它是第一个从人体肠道黏膜中分离出来并被定性的酶。该酶具有较强的温度耐受性且反应的pH环境偏酸性，扩大了应用条件范围，丰富了β-半乳糖苷酶基因的研究库。同时，该伊半乳糖苷酶具有强大的水解能力和特殊的底物连接位点以及键型特异性，能够高效水解各种寡糖底物非还原性末端的β1，3-和β1，6-连接的半乳糖，为糖生物学研究提供了一种重要的工具酶，具有极大的潜在利用价值。