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目的本研究目的是探索采用普通冻存管作为人类射出的精液或睾丸活检获取的精子的冷冻载体,并使用-80℃冰箱冷冻保存射出的精子或睾丸活检获取精子的可行性。方法本研究使用普通冻存管装载精子,比较液氮蒸汽快速冷冻法（Liquid nitrogen vapor rapid freezing,LNV-RF）和-80℃冰箱冷冻法（-80?°C freezer,-80℃-F）对冻融后精子质量的影响。首先使用超低温温度探测仪检测并比较使用LNV-RF和-80℃-F两种方法在普通冻存管中冷冻精液-冷冻保护剂混合液的温度下降曲线。再使用LNV-RF和-80℃-F两种不同冷冻方法对正常射出精液进行冷冻保存,评估冻融后精子质量,并比较两种方法冻融睾丸精子后精子的活动率。具体方法为:招募并收集在2021年3月至2021年12月于中国科学技术大学第一附属医院（安徽省立医院）男科化验室就诊的男性患者精液,根据世界卫生组织（World Health Organization,WHO）第五版《人类精液检查和处理实验室手册》标准常规检测,纳入正常精液93份;并收集因梗阻性无精子症行睾丸穿刺术（Testicular sperm aspiration,TESA）患者的睾丸组织10份。使用ORIGIO（（?）,Denmark）公司精子冷冻保护剂,按说明书操作,平衡后分别采用LNVRF和-80℃-F冷冻精液。实验分为四个部分:（1）比较两种方法冷冻保存24小时和2个月解冻后精子存活率以及前向运动差异（N=30）;（2）比较两种方法冷冻保存24小时和2个月解冻后精子存活率以及前向运动等精子动力学指标和活性氧含量（Reactive oxygen species,ROS）,线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential,MMP）,DNA碎片（DNA fragmentation index,DFI）,DNA凝集（High DNA stainability,HDS）等精子功能参数的差异（N=33）;（3）比较两种方法冷冻一周解冻后精子顶体反应（Acrosome reaction,AR）的差异（N=30）;（4）比较两种方法冷冻保存睾丸精子一周,解冻后使用己酮可可碱激活然后在一定体积样本中活动精子数占所有精子数的比例（N=10）。精子活力的检测使用计算机辅助精液分析（Computer-assisted semen analysis,CASA）检测。精子ROS,MMP,DFI和HDS使用流式细胞仪检测。精子AR使用荧光显微镜计数。睾丸精子活力使用光学显微镜计数精子计数板内所有精子数量以及活动精子的占比。使用配对样本t检验比较两种方法是否有统计学差异并采用线性回归分析冻融后精子的质量是否与精子冷冻前的前向运动、ROS,MMP,DFI和HDS以及冷冻时间和冷冻方式有关。结果（1）在常规精子冻存管内使用LNV-RF和-80℃-F两种冷冻方法,精液-冷冻保护剂混合物温度下降曲线显示从室温23.1℃降至-80℃分别需要6.83min和33.17min。-80℃-F降温速率（3.11℃/min）低于LNV-RF降温速率（15.10℃/min）。在冷冻开始的前5min,-80℃-F降温速率为12.62℃/min,LNV-RF降温速率为18.22℃/min。在-80℃-F冷冻过程中,精液混合物的凝固点为-8.7℃,而在LNV-RF冷冻过程中,精液混合物的凝固点为-12℃。（2）与冷冻前精子相比,两种方法冷冻保存24小时后,精子存活率、前向运动率下降（p＜0.05）;精子ROS,MMP,DFI没有显著变化（p＞0.05）。随着冷冻保存时间的延长（2个月）,精子存活率和前向运动进一步下降,精子MMP下降,HDS升高（p＜0.05）。（3）LNV-RF和-80℃-F冷冻保存精子24小时（短期冷冻）或2个月（长期冷冻）后,两种方法冷冻-解冻后精子存活率和前向运动率没有显著差异（p＞0.05）。（4）在短期冷冻组（24小时）中,与短期LNV-RF冷冻相比,-80℃-F冻融后精子ROS较低（7.45%±7.14%vs.9.53%±8.47%;p=0.036）,两种方法冻融后精子MMP、DFI和HDS没有差异（p＞0.05）。（5）在长期冷冻组（2个月）,与LNV-RF相比,-80℃-F冷冻后精子ROS较低（11.64%±8.13%vs.12.94%±9.46%;p=0.022）,HDS较高（9.10%±2.88%vs.8.46%±2.90%;p=0.017）;MMP、和DFI没有差异（p＞0.05）。（6）LNV-RF和80℃-F两种方法冷冻-解冻后精子AR均较冷冻前显著增加（冷冻前AR:9.23%±4.61%;LNV-RF冷冻后AR:14.62%±6.86%;80℃-F冷冻后AR:14.38%±6.05%;p＜0.001）,但是两种方法之间冻融后精子AR差异无统计学意义（14.62%±6.86%vs.14.38%±6.05%;p＞0.05）。（7）回归分析显示:冷冻前精子前向运动与冷冻后精子前向运动有呈正相关（β=0.30;p＜0.001）,冷冻前精子的ROS,DFI和长期冷冻与冷冻后精子前向运动存在负相关（冷冻前ROS:β=-0.13;p=0.010冷冻前DFI:β=-0.44;p＜0.001长期冷冻:β=-2.49.;p＜0.001）。冷冻前精子ROS和长期冷冻与冷冻后精子ROS存在正相关（冷冻前ROS:β=0.19;p=0.021;长期冷冻:β=3.80;p=0.008）。冷冻前精子前向运动与冷冻后精子DFI存在负相关（β=-0.14;p＜0.001）,冷冻前精子DFI与冷冻后精子DFI有正相关（β=0.93;p＜0.001）。（8）采用常规精子冻存管,使用LNV-RF和-80℃-F冷冻10例睾丸精子冻融后活动精子占总精子比例无显著差异（16.89%vs.17.02%;p＞0.05）。结论（1）-80℃-F和LNV-RF冻融精子后,精子常规精液质量参数没有较大差异。（2）-80℃-F可以在短期作为替代LNV-RF的方法,如需要长期冷冻保存精子,可以使用-80℃-F作为降温程序对精子进行降温,然后在2至24小时内转移到液氮中长期保存。（3）-80℃-F和冻存管联合使用可以对全部睾丸活检获得的精子进行冷冻,冻融后用己酮可可碱激活可以获得更多活动精子用于卵胞浆内单精子注射（Intracytoplasmic sperm injection,ICSI）。