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茚满霉素(Indanomycin)和Thiostreptamide S4是由链霉菌次级代谢产生的具有潜在抗肿瘤活性的重要天然产物,因其独特的化学结构以及良好的生物活性,引起了不少生物学家的广泛兴趣,其生物合成基因簇已经被鉴定。本论文就茚满霉素的环化机制进行探索,并将Thiostreptamide S4生物合成基因簇在不同的底盘细胞中进行异源表达。茚满霉素最早是从抗生素链霉菌Streptomyces sp.NRRL 8167的发酵液中分离得到的,含有反式四氢茚满环(indan)和吡咯酮结构,其生物合成基因簇为idm,其骨架通过杂合的非核糖体肽合成酶-聚酮合酶(NRPS-PKS)复合物组装。本论文通过同源重组双交换的方法构建了Idm H环化酶缺失菌株8167-idm H M,对重组菌株进行发酵、提取、分离后得到了两个化合物,经鉴定为茚满霉素和一个直链四烯。与野生菌株相比,茚满霉素的产量明显降低,直链四烯的产量明显提高。为了进一步鉴定Idm H环化酶的功能,将Idm H在链霉菌S.lividans TK24和大肠杆菌BL21中异源表达,构建了TK24-idm H和BL21-idm H菌株并进行酶反应,结果显示环化酶Idm H不能使直链四烯及其类似物环化生成茚满霉素。为了探究直链四烯的生物合成机制,本研究中将模块3中的DH结构域失活,构建8167-DH和8167-idm H M-DH菌株。对8167-idm H M-DH菌株进行发酵提取,并进行LC-MS分析,结果显示发酵液中检测到一个[M+H]~+分子离子峰为512.2656的化合物,该结果显示,直链四烯的形成可能与模块3中的DH和ER被使用两次无关,该研究为后续研究茚满霉素的生物合成机制奠定了基础。Thiostreptamide S4是近几年从Streptomyces sp.NRRL S-4中分离得到的一种结构新颖的核糖体合成和翻译后修饰的肽,含有4个硫肽键以及1个Avi Me Cys残基,其生物合成基因簇为tsa。在野生菌株NRRL S-4中,Thiostreptamide S4的产量低,且分离难度大。为了提高Thiostreptamide S4的产量,本研究中将20kbp左右的基因簇tsa导入NRRL S-4菌株中,构建了S4-tsa重组菌株,并对于其发酵液进行LC-MS分析,分析结果显示,基因簇tsa拷贝数的增加能够有效的提高Thiostreptamide S4的产量,S4-tsa中Thiostreptamide S4的离子流强度为野生菌株中该化合物离子流强度的5倍左右。将基因簇tsa在不同的底盘细胞(S.lividans TK24,S.lividans 1326和S.albus)中异源表达,构建得到了异源表达菌株TK24-tsa,1326-tsa和S.albus-tsa,对这三个重组菌株的发酵液进行LC-MS分析,分析结果显示,重组菌株TK24-tsa和S.albus-tsa均能产生Thiostreptamide S4,且重组菌株TK24-tsa的Thiostreptamide S4的产量与野生菌株的产量相近,但是1326-tsa的发酵液中没有检测到该化合物的产生。为了探究核心肽tsa A基因片段的强化表达对其产量的影响,将核心肽tsa A基因片段导入重组菌株TK24-tsa和S.albus-tsa中,构建了TK24-tsa-tsa A和S.albus-tsa-tsa A菌株,并对这两个菌株的发酵液进行LC-MS分析。分析结果显示,核心肽tsa A基因片段的强化表达能够有效的提高Thiostreptamide S4的产量,虽然TK24-tsa-tsa A中Thiostreptamide S4的产量与TK24-tsa中的产量相当,但是S.albus-tsa-tsa A中Thiostreptamide S4离子流强度比S.albus-tsa中该化合物离子流强度增加了将近100倍。该结果表明核心肽tsa A基因片段的强化表达能够极大的提高Thiostreptamide S4的产量,而且S.albus-tsa-tsa A中Thiostreptamide S4的离子流强度为野生菌株中该化合物离子流强度的4倍左右。