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海洋作为覆盖地球表面积超过70%的最大水体,其中的生物资源非常丰富,藻类作为海洋中的生产者扮演着重要的角色,作为大型藻之一的褐藻更是许多海洋微生物的营养来源,褐藻的主要成分是褐藻胶,褐藻胶及其寡糖在食品、医药、农业和化妆品等领域均有着广泛的应用,因此褐藻胶具有着很大的应用潜力和市场前景,利用酶解法获取褐藻寡糖比化学降解法污染更小,但是目前仍没有发现高效可工业化生产利用的褐藻胶裂解酶。本研究旨在对52株海藻附生细菌基因组中碳水化合物活性酶基因进行初步的整理分析及筛选分离具有较高活性的褐藻胶降解菌株,并对其褐藻胶裂解酶基因进行外源表达。研究结果如下:1.完成了 52株海藻附生细菌的基因组草图测序分析,根据16S rRNA基因序列和CAZy数据库比对,分析了微生物的多样性和碳水化合物降解酶编码基因的多样性。根据16S rRNA基因序列分析,来自本实验室之前从藻类表面分离得到的52株菌在门水平上的分布为变形菌占51.92%、拟杆菌门为38.46%、厚壁菌门为7.69%、放线菌门为1.92%;优势目为黄杆菌目,优势科为黄杆菌科,在属的分类水平上,水生杆菌属和红杆菌属丰度较高。碳水化合物活性酶基因注释结果表明,所有菌株中GT家族蛋白基因最多为5033个,GH家族蛋白基因4696个,CBM家族蛋白基因2700个,CE家族蛋白基因2319个,PL家族蛋白基因444个,AA家族蛋白基因305个,共计15497个碳水化合物活性酶基因。功能基因注释预测到在34株菌中具有165条与褐藻胶裂解相关的功能基因,其中有68条分布在变形菌门中,包括MBOAT家族、PL7,PL6,PL17 家族、LytT 家族、ALGX 家族、HeparinaseⅡ/Ⅲ-like protein 家族和甘露糖醛酸特定底物褐藻胶裂解酶;在拟杆菌门中注释到了 97条褐藻胶裂解相关功能基因,除了以上的家族以外,还发现了 Alginate export家族和Pgu1家族的基因。2.完成了 52株海藻附生细菌的褐藻胶降解活性验证,并进一步对三种藻类样品进行了褐藻胶降解活性菌株的筛选,得到了多株具有潜在褐藻胶降解活性的菌株和潜在新物种。经过活性点板实验验证,52株菌中有共22株菌具有褐藻胶降解活性。进一步对三种藻类表面进行处理,初筛共得到71株潜在褐藻胶降解菌株,分布在拟杆菌门、变形菌门、厚壁菌门和放线菌门4个门,23个属中。根据16S rRNA基因相似性<98%的标准,初筛得到的菌株中包含16株潜在新物种。然后对经过活性验证的活性菌株及这71株菌的发酵粗酶液的相对酶活进行测定,得到了 10株降解能力较强的菌株,其中相对酶活最高的为菌株M269,其次为菌株M341。根据NCBI和EzTaxon-e数据库中的比对结果显示,菌株M269的最相似菌株为 Alteromonas aestuariivivens JDTF-113T(94.50%),菌株 M341 最相似菌株为Tenacibaculum sediminilitoris YKTF-3T(97.06%)。从遗传学、生理生化特征和化学特征等方面对菌株M341进行了多相分类,结果表明菌株M341为革兰氏阴性、兼性厌氧、无鞭毛的杆状细菌,主要脂肪酸为iso-C15:0、iso-C15:00G和summed feature 3,主要呼吸醌为MK-6,极性脂的主要成分是磷脂酰乙醇胺、一种未知的糖脂和氨基脂,再结合遗传学特征可以确定菌株M341是拟杆菌门、黄杆菌纲、黄杆菌目、黄杆菌科、附着杆菌属的一个新物种。3.完成了菌株M269和M341中9条褐藻胶裂解酶基因的外源表达,及蛋白AL341-1诱导条件的优化。成功地对菌株M269和M341中的9条褐藻胶裂解酶基因进行了外源表达,al269-1、al269-6和al269-9经过诱导以后表达的蛋白位置处于破碎沉淀中,活性平板检测发现破碎沉淀组分均有活性;al269-7的表达位于破碎上清组分中,但是活性检测发现没有出现透明降解圈;al269-8和al341-1的表达产物位于破碎上清组分中,且活性检测结果为破碎上清组分有活性,说明这两个酶为可溶性蛋白;al341-2和al341-3均未被诱导表达成功。重组褐藻胶裂解酶AL341-1的最佳诱导条件是初始菌密度OD600=0.8、诱导剂IPTG浓度1.0 mmol/L、诱导时间9 h和诱导温度20℃。