牛肉嫩度的不一致性和可变性是当今肉类工业面临的两大主要问题，解决这两个问题的先决条件是必须深入了解产生这种可变性的机理及其肉类嫩化的机制。 Calpains是公认的在肉的成熟过程中起关键作用的酶类，编码μ-calpain大亚基的基因canpl也被称为“嫩度基因”。本研究旨在：(1)探讨牛肉LM嫩度与canpl基因mRNA含量之间的关系； (2)研究外源钙离子对以L6成肌细胞为代表的活体肌纤维中μ-、m-calpain和calpain3 mRNA表达量和酶活性的影响;(3)用钙离子处理刚屠宰后牛肉肌肉束，模拟钙离子对死后成熟过程中牛肉的肌原纤维蛋白降解、超微结构变化以及酶激活的影响； (4)探讨钙离子对组织特异性calPain3自动降解的作用。1.基于钙激活内源蛋白酶理论所确定的嫩度基因，利用能够准确反应模板中mRNA含 量的荧光实时定量PcR方法，研究9头刚刚屠宰后、年龄和膘情相似的中国黄牛 LM中mRNA含量与成熟3天后LM的嫩度之间的关系。结果表明，中国黄牛因个 体不同，LM肌肉的剪切力存在较大的差别。试验的9头牛中，剪切力最大的为 12.7kg，而最小的只有5.6kg。不同牛个体间mRNA含量也表现出很大的不一致性， 最大与最小之间有10倍之差。将肉块的mRNA含量和剪切力值做回归，得出了回 归方程：Y=-3147.9Ln(x)+9645.7，相关系数高达0.8557，表明CANPl的mRNA含 量与嫩度之间有很好的相关性。 2.研究认为，μ-caLlpain、m-calpain和calp3与肉的嫩化有关。钙离子是calpains家 族成员活化、分解肌肉骨架蛋白必不可少的因子。本研究利用分化的L6成肌细胞 来模拟活体肌纤维，探讨钙离子处理活体细胞是否引起μ-calpain、m-calpain和3 mRNA水平上表达的变化，以及对λμ-calpain和m-calpain的活性是否产生影响。结 果发现，钙离子处理活体细胞引起细胞内游离钙离子的相应升高，从而使μ-calpain 和m-calpain在mRNA水平表达的升高，对caLlpain3的影响不大。钙离子可以诱导 μ-calpaill的活性发生变化，除了表达量增加外，随着钙离子浓度的升高，还出现 76kDa的降解产物。钙离子对m-calpain活性的影响不大。 3．刚屠宰后的牛，顺肌纤维方向，撕下一小束肌束，进行钙离子浸泡处理，研究钙离 子处理对肌肉蛋白降解和超微结构的影响。结果显示，钙离子处理肌束可以极大提 高肌肉蛋白的降解能力，并使肌原纤维的结构发生变化；随着钙离子浓度的提高， 肌原纤维的无序性增大。钙离子处理可以显著改变μ-calpain的活性。当钙离子浓 度低于1500μM时，对μ-calpain的活性有促进作用；当钙离子高于5mM时，μ -calpain因降解而失去活性。钙离子浓度小于5mM时，m-calpain的活性变化不大， 但是当浓度为10mM时，也因自动降解而失去活性。 4．Calpain3结构中含有钙离子结合结构域，理论上应受钙离子的调控，但是由于 calpain3迅速降解特性使得在calpain3钙调节问题上存在很多分歧。本研究采用钙 离子处理calpain3的粗酶液，利用免疫印迹分析检测其降解进程。结果表明，牛屠 宰后立即进行calpain3的抽提，也会发生calpain3的降解，分离出分子量分别为94、 89、58和55kDa的4种片段，其中94kDa片段为优势片断。当用不同浓度钙离子 处理calpain3抽提物30min后，利用NaCl为对照，发现NaCl和CaCl<,2>处理都可以 加速calpain3的降解，94kDa片段减少，55kDa片段增加，钙离子浓度对降解的影 响不大。