急性肺栓塞(Acute pulmonary embolism, APE)是指以各种栓子堵塞肺动脉系统为发病原因的一组疾病的总称,因其发病率和病死率逐年增高而受到人们关注。目前溶栓治疗虽然是临床上推荐使用的方法,但经过系统的溶栓方案治疗后该病死亡率并未明显降低,造成这种现象的原因可能与溶栓早期出现的肺缺血-再灌注损伤(lung ischemia-reperfusion injury, LIRI)相关。肺缺血-再灌注损伤是指包括急性肺动脉栓塞在内的多种原因形成肺缺血的基础上恢复血流灌注后肺组织损伤加重的现象。有研究报道认为引起肺缺血-再灌注损伤的因素复杂多样,其中内皮素在肺缺血-再灌注损伤发病机制中起着重要的作用。内皮素是最强烈的血管平滑肌收缩物质,尤其对肺小血管有更强的收缩力,因此可以促进机体组织缺血缺氧,近年来拮抗内皮素的效应对抗缺血-再灌注损伤的研究取得重大进展,但BQ-123作为一种新型选择性内皮素-1型受体拮抗剂,在对抗肺缺血-再灌注方面的研究报道较为少见。本实验通过建立兔自体血凝块急性肺栓塞模型,在溶栓时给予内皮素-1受体拮抗剂BQ-123进行干预,并分别于栓塞前即刻、栓塞后0.5h、2h、4h监测记录肺动脉压力同时采静脉血检测血浆ET-1浓度,实验结束后测肺组织的湿/干比值(W/D比值)、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量变化,将肺组织经戊二醛固定、包埋切片,透射电镜下观察细胞超微结构变化,借以探讨BQ-123对兔急性肺栓塞模型溶栓时缺血-再灌注损伤的保护作用,本课题研究共分为以下三个部分完成。目的：建立兔自体血凝块急性肺栓塞模型方法：1.动物分组：健康日本大耳白兔(普通级)12只,体重(3.0±0.5)kg,性别不限,随机分成SHAM组(假手术组)、PE组(肺栓塞组),每组6只。2.动物模型的建立：10%水合氯醛4ml/kg腹腔注射,麻醉满意后行气管切开插管,DH-150型小动物呼吸机机械通气,呼吸频率50次/分,潮气量10ml/kg,吸：呼比为1：2,美国惠普M3046A心电监护仪监测生命体征；纵剪胸骨,经主肺动脉根部向左上肺插入20G套管针连接压力感受器；游离出右侧股静脉、右侧股动脉分别插入血管留置针；右侧股静脉抽取血液2ml置于无菌注射器内,静置待自然凝固备用；右侧股动脉用于监测动脉血压,右侧股静脉用于注射液体及药物。SHAM组：呼吸机机械通气后,测肺动脉平均压力后将无菌生理盐水0.3ml/kg经套管针缓慢注入肺动脉。PE组：呼吸机机械通气后,测肺动脉平均压力后将自体血凝块0.3ml/kg经肺套管针缓慢注入,其余操作同SHAM组。3.样本的采集及指标测定：记录栓塞前、栓塞后0.5h、2h、4h各时间点MPAP值。注栓后4h处死动物解剖肺脏观察肺动脉栓塞情况,并取左上肺栓塞区组织约1g,电子分析天平称重为湿重,置于80℃电热恒温干燥箱中烤48h称重为干重,计算湿重/干重比值(W/D)。将左上肺栓塞区组织经戊二醛固定、包埋切片,电镜下观察细胞超微结构变化。血浆ET-1浓度：分别于栓塞前即刻、栓塞后0.5h、2h、4h自右侧股静脉抽取血液2ml置于EDTA管内,4℃环境下3000r/min离心15min,取血浆以ELISA法检测血浆ET-1浓度,操作严格按试剂盒说明书进行。肺组织超氧化物歧化酶(SOD)活性,丙二醛(MDA)含量测定：实验结束取后左上肺栓塞区组织约1克与生理盐水按1：9混合,肺组织匀浆,4℃环境下3000r/min离心15min,取上清液采用比色法检测SOD活性及MDA浓度,操作严格按试剂盒说明书进行。4.统计学方法：应用SPSS19.0统计软件分析,数据采用均数·标准差(x±s)表示；数据处理先行方差齐性检验,方差齐者再采用独立样本t检验,P<0.05认为有统计学意义,保留三位小数。结果：(1)平均肺动脉压力变化：经方差齐性检验认为具有齐性,经独立样本t检验分析认为,栓塞前组间差异无统计学意义(t=-1.061,P=0.314)；经独立样本t检验分析栓塞后各时间点各组间比较有差异(t0.5h=-10.471、t2h=-16.189、t4h=-16.490,P=0.000),独立样本t检验认为PE组与SHAM组在栓塞后各时间点比较平均肺动脉压力升高(P<0.01)。(2)肺组织湿/干重比(W/D)测定：经检验认为方差具有齐性,经独立样本t检验分析认为SHAM组W/D与PE组比较有差异(t=-7.865,P=0.000),且PE组与SHAM组比较W/D增大(P=0.000)。(3)沿肺动脉系统解剖肺脏SHAM组未见血栓形成,PE组可于左上肺肺动脉系统内发现多量血栓,而在右肺动脉系统内仅见少量血栓；透射电镜下观察到PE组内皮细胞肿胀、肺Ⅱ型上皮细胞线粒体肿胀、嵴不清或消失、板层小体空泡化。结论：1.采用微量泵向左上肺动脉缓慢注入0.3ml/kg自体血凝块可以建立兔急性肺栓塞模型。2.兔急性肺栓塞发生后肺动脉压力升高、肺组织湿/干重比(W/D)变化提示急性肺栓塞后出现了肺损伤。目的：观察急性肺栓塞溶栓后肺缺血-再灌注损伤方法：1.动物分组及模型的建立：健康日本大耳白兔(普通级)18只,体重(3.0±0.5)kg,性别不限,随机分成3组,每组6只,即SHAM组(假手术组)、PE组(肺栓塞组)、UK组(尿激酶组)。SHAM组：同第一部分。PE组：同第一部分。UK组：溶栓组,在栓塞后0.5h经肺动脉套管针缓慢微量泵入尿激酶2万U/kg,2h内注毕,同时给予肝素钠盐水抗凝,其余操作同PE组。2.样本的采集和指标的测定：MPAP值、W/D比值、左上肺栓塞区组织超氧化物歧化酶(SOD)活性,丙二醛(MDA)含量测定、血浆ET-1浓度采集同第一步。SHAM组兔在注入生理盐水后4h,PE组、UK组兔在注入自体血凝块后4h处死,解剖肺动脉系统观察栓塞情况,将左上肺栓塞区组织经戊二醛固定、包埋切片,电镜下观察肺组织细胞超微结构变化。3.统计学方法：应用SPSS19.0统计软件分析,数据采用均数±标准差(x±s)表示；组间数据处理采用单因素方差分析,两两比较采用LSD检验,P<0.05认为有统计学意义,保留三位小数。结果：(1).平均肺动脉压力(MPAP)变化：经单因素方差分析认为栓塞前组间差异无统计学意义(F=1.400,P=0.277)；采用单因素方差分析显示各组间在栓塞后2h(F=126.206,P=0.000)、4h有差异(F=141.075,P=0.000),经过LSD方法对各组间进行多重比较认为UK组MPAP在栓塞后2h、4h时均低于PE组(P均<0.01)。(2).血浆ET-1浓度变化：采用单因素方差分析显示在栓塞前三组间血浆ET-1浓度差异无统计学意义(F=0.084.P=0.920)；在栓塞后各时间点,三组间血浆ET-1浓度有差异(Fo.5h=30.611、F2h=197.901、F4h=213.732,P均=0.000),经过LSD方法对在栓塞后各时间点各组间进行多重比较显示PE组与UK组在栓塞后0.5h无差异(P=0.272),但在栓塞后2hUK组血浆ET-1浓度高于PE组(P=0.003),在栓塞后4h两组间无差异(P=0.957),栓塞后2hUK组血浆ET-1浓度高于PE组(P<0.01)。(3).肺组织SOD浓度、MDA含量变化：经单因素方差分析认为三组间MDA含量(F=37.897,P=0.000)、SOD活性(F=31.152,P=0.000)有差异,经过LSD方法对各组间进行多重比较认为与SHAM组比较,PE组、UK组MDA含量升高,SOD活性降低(P均<0.01,)；与UK组比较,PE组MDA含量升高(P<0.01),SOD活性降低(P=0.001)(4).肺组织湿/干重比值(W/D)测定：采用单因素方差分析显示各组间UK组与PE组W/D比较有差异(F=105.246,P=0.000),经过LSD方法对各组间进行多重比较认为UK组比PE组W/D升高(P<0.001)。(5).沿肺动脉系统解剖肺脏可见UK组血栓与PE组比较肺动脉系统内未见明显血栓,透射电镜下见UK组肺Ⅱ型上皮细胞大量板层小体形成,核固缩,内皮细胞肿胀断裂,内皮细胞肿胀更加明显。结论：急性肺栓塞发生后出现了明显的肺损伤；UK组SOD水平升高、MDA含量降低以及肺组织湿/干比重(W/D)升高等结果变化,提示急性肺栓塞经过溶栓治疗恢复血流灌注后,肺损伤出现了加重的现象,即出现了肺缺血-再灌注损伤。目的观察ET-1受体拮抗剂BQ-123对兔急性肺栓塞溶栓后肺缺血-再灌注损伤的保护作用。方法1.动物分组及模型建立：健康日本大耳白兔(普通级)24只,性别不限,体重(3.0±0.5)kg,随机分成4组,即SHAM组、PE组、UK组、BQ+UK组,每组6只。SHAM组、PE组、UK组模型建立在第一、二部分完成,BQ+UK组在栓塞后0.5h经右侧股静脉注射BQ-123,剂量为50μg/kg,经肺动脉套管针缓慢微量泵入尿激酶2万U/kg,2h内注毕,余实验操作同UK组。2.指标采集及测定、统计学方法同第二部分。结果(1)实验结束时解剖肺脏组织,发现UK+BQ组左上肺系统内未见明显血栓形成,UK+BQ组肺Ⅱ型上皮细胞线粒体可见轻微空泡化,内皮细胞肿胀减轻；(2)平均肺动脉压力(MPAP)变化：采用单因素方差分析显示栓塞前组间差异无统计学意义(F=1.382,P=0.277)；栓塞后各时间点组间有差异(Fo.5h=49.277、F2h=102.393、F4h=113.803,P=0.000),经过LSD方法对各组间进行两两比较显示在栓后2h、4h,UK组、UK+BQ组比PE组降低(P均<0.01)。(3)血浆ET-1浓度变化：采用单因素方差分析显示在栓塞后各时间点组间比较均有差异(Fo.5h=25.553、F2h=148.401、F4h=161.716,P均=0.000)；经过LSD方法对各组间进行两两比较显示栓后2h,UK+BQ组与UK组差异无统计学意义(P=0.346)；在栓塞后4hUK+BQ组低于UK组,差异具有统计学意义(P=0.000)。(4)肺组织SOD浓度与MDA含量变化：采用单因素方差分析显示各组间相比,MDA含量(F=36.409,P=0.000)、SOD活性均有差异(F=19.489,P=0.000),经过LSD方法对各组间进行两两比较显示与SHAM组比较,UK组MDA含量升高,SOD活性降低(P均<0.01)；与UK组相比,UK+BQ组MDA含量降低,SOD活性升高(P均<0.01)。(5)肺组织W/D比值变化：采用单因素方差分析显示组间比较有差异(F=86.343,P=0.000),经过LSD方法对各组间进行两两比较显示UK+BQ组与UK组比较,W/D比值升高(P=0.029)。结论UK+BQ组与BQ组比较W/D比值增加,SOD水平升高、MDA含量降低提示BQ-123对APE溶栓后肺缺血再灌注损伤起到保护作用。