乳酸菌是一类能够利用碳水化合物产生乳酸的革兰氏阳性细菌的统称,是一群由多个属组成的庞杂细菌群体,主要包括乳球菌属(Lactococcus),乳杆菌属(Lactobacillus),片球菌属(Pediococcus),链球菌属(Streptococcus),肠球菌属(Enterococcus),双歧杆菌属(Bifidobacterium)等。大多数乳酸菌对人体有益,它们通过降解糖类、蛋白和脂肪产生多种生物活性物质促进人体健康。此外,大部分乳酸菌本身就是益生菌(probiotics),其益生性质体现在维持人体肠道菌群平衡、调节人体免疫以及抑制有害病原微生物的生长等多个方面。乳酸菌有些益生功能与细菌表面性质有关,比如絮凝(aggregation)、黏附(adhesion)、自溶(autolysis)等。自溶(自裂解),是指细菌在生长繁殖的某个阶段因肽聚糖水解酶(自溶酶)的作用而引起的自身裂解的现象。自溶酶除了裂解细胞发生自溶外,还参与细菌生长代谢的多个生理过程,如新合成肽聚糖的延伸、细胞增大以及子代细胞的产生等,是一类极其重要的细胞壁水解酶类。研究表明,有些抗生素、细菌素的抗菌作用也是通过肽聚糖水解酶的活性而完成的,因此对肽聚糖水解酶的深入认识对于揭示乳酸菌的益生作用以及充分发挥抗生素的杀菌作用尤为重要。除了作为益生菌剂,乳酸菌还是重要的工业微生物菌株,在食品加工、乳制品发酵等领域具有悠久的应用历史,是公认的安全级(Generally Regarded as Safe, GRAS)微生物。有些乳酸乳球菌和乳杆菌作为发酵剂广泛应用于奶酪的生产。其中,奶酪的成熟过程是一个缓慢而昂贵的过程,而乳酸菌发酵剂的自溶释放出的脂肪酶、蛋白酶有利于风味物质的形成和奶酪的成熟,因此实时控制和深入认识自裂解机制是加速奶酪成熟的有效手段。截至目前,很多研究都着重于通过基因工程的方法构建可控裂解的乳酸乳球菌发酵剂菌株从而达到控制与缩短奶酪成熟时间的目的。而遗憾的是,发酵剂菌株的过度裂解会导致正常细胞数量减少,从而引起乳糖的过量剩余和奶酪性质的不稳定。所以,在非发酵剂菌株(主要指乳酸杆菌)中构建可控裂解系统可有效避免上述问题的发生。乳酸菌基因组小、代谢简单、蛋白酶活力弱、易于进行人工改造等特征使其成为微生物学及分子生物学研究中的重要模式菌株。其中乳酸乳球菌已建立起较完善的遗传操作系统,利用严谨型启动子NisA可控表达系统(the nisin-controlled expression, NICE)已实现了多种异源蛋白的表达。由于乳酸菌是单分子膜,遗传操作系统可控性强,它还是膜蛋白表达的良好宿主本论文主要以乳酸乳球菌与干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)为实验材料,以自溶性质以及膜蛋白表达为研究重点,构建了一个新的高效乳酸菌膜蛋白表达载体,实现了绿色巴夫藻Δ4去饱和酶和嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶在乳球菌中的过量表达；并且对乳酸菌的自溶性质以及相关肽聚糖水解酶的鉴别与生物特性进行了研究和探讨。具体的工作内容和取得的结果如下：1.多不饱和脂肪酸合成相关功能基因的克隆与表达多不饱和脂肪酸是人体所必需却不能自然合成的重要营养物质,其相关合成基因的克隆和表达是研究者关心的热点。本文以绿色巴夫藻(Pavlova viridis)为材料,通过反转录、SEFA-PCR (self-formed adaptor PCR)、SOE (splicing by overlap extension)等方法分别扩增得到了在EPA(二十碳五烯酸)与DHA(二十二碳六烯酸)合成中起重要作用的△5去饱和酶和A4去饱和酶的基因全长及表达序列。与之前实验室克隆和特征化的C20延伸酶(△5延伸酶)一起,完成了对绿色巴夫藻中EPA和DHA合成所涉关键基因的全部克隆工作。其中,Δ4去饱和酶与其同源蛋白有75%的同源序列。为了研究该酶的性质,在尝试以大肠杆菌和毕赤酵母为宿主利用多种载体表达A4去饱和酶时均没有成功,主要原因是膜蛋白的过量表达对宿主细胞有毒害作用。随后,将来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、能够自动折叠于细胞膜的整合型膜蛋白短肽Mi stic与Δ4去饱和酶进行融合连接,结果实现了A4去饱和酶在大肠杆菌的过量表达。目的蛋白条带在SDS-PAGE中显著可见,此研究成为真核微藻多不饱和脂肪酸去饱和酶基因在原核生物中高效表达的首个成功例证。2.乳酸乳球菌高效膜蛋白表达载体的构建与应用膜蛋白对真核与原核细胞的生命活动具有重要作用,比如信号传导、能量转换、营养物质转运等。在已测序的基因组中,膜蛋白占据所有开放阅读框(ORF)的20%到25%。可是相比于可溶蛋白的研究,已明确结构特征和生化基础的膜蛋白数量很少,而通过异源表达制备具有高分辨率结构的膜蛋白则更是屈指可数。阻碍膜蛋白研究的一个重要瓶颈就是膜蛋白过量表达。在Mi stic介导Δ4去饱和酶在大肠杆菌表达工作的基础上,进一步以乳酸乳球菌为宿主,以pNZ8148为骨架,结合Mi stic结构元件构建了一个膜蛋白表达载体pNM110,探讨和改进膜蛋白在乳酸乳球菌中的表达。通过Mi stic与GFP的融合表达和GFP荧光的检测,证实了短肽Mi stic可以成功插入乳酸乳球菌的细胞膜,并且具有促进膜蛋白过量表达的潜力。为了验证该载体在乳球菌中表达膜蛋白的有效性,将克隆自绿色巴夫藻的A4去饱和酶基因pkjDes4和嗜酸乳杆菌的亚油酸异构酶基因pkjLi分别与Mistic融合连接,构建了重组载体pNMDes4和pNMLi,并成功实现了上述两种膜蛋白在乳酸乳球菌中的过量表达,其表达水平分别达到了膜蛋白总量的4.4%与45.2%,这个表达水平是目前以乳酸乳球菌为宿主表达膜蛋白产量最高的。为了进一步验证所表达亚油酸异构酶的功能,将重组的乳酸乳球菌菌株与底物亚油酸在一定条件下培养,结果发现重组乳酸菌具有转化亚油酸生成共轭亚油酸的能力,产量可达0.852mg/ml,转化率为28.4%,该结果首次实现了乳杆菌亚油酸异构酶的异源表达和功能鉴定。3.乳酸菌自溶性质的研究细菌编码的自溶酶除了用于细胞分裂产生子代细胞外,对于乳酸菌来说,还有一个重要的作用是在乳酪成熟中释放出胞内水解酶类而有助于风味物质的形成和缩短成熟时间;同时自溶酶具有对病原微生物的杀菌效果而可作为杀菌剂用作菌种保藏。因此对自溶酶和自溶表型的研究为乳酸茵的研究热点之一。本文采用GM17和MRS选择培养基,结合不同培养条件,先后从发酵乳、鸡肠道和人粪便等不同生境中分离得到了多株乳酸菌并对其自溶能力进行了测量和筛选。结果发现,同种细菌不同菌株之间的自溶能力有显著差异,这说明自溶具有高度菌株特异性。此外,粪肠球菌的自溶能力明显强于乳酸乳球菌。以抗生素为代表的生长抑制剂的使用是诱发细菌自溶现象的一个重要途径。本文检测了多种生长抑制剂在不同生长时期对乳酸乳球菌自溶性质的影响。结果表明,某些抗生素能够在碳源严格限制性培养基中对处于特定生长时期的乳酸乳球菌产生显著裂解的现象,而且抑制细胞壁合成类抗生素的促自溶效果更为明显,这些结果对于研究抗生素与乳酸菌自溶的关系以及乳酸菌自溶的调控机制提供了实验依据。4.干酪乳杆菌肽聚糖水解酶AclB的鉴别与生物特性研究相比于乳酸乳球菌,除了植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的Acm2外,尚无乳杆菌肽聚糖水解酶鉴别与生物特性研究的报道。本文以干酪乳杆菌为研究对象,鉴别并克隆到5种推定的肽聚糖水解酶(自溶酶)基因,并对非内肽酶的基因在指数生长时期的不同阶段的表达情况做了测定,发现它们在指数期的转录量有着相似的变化趋势。随后,AclA与AclB分别在大肠杆菌中进行了大量表达和纯化。酶活性质测定表明,AclB在pH5.0的酸性条件下具有最大的水解活性,而最适温度是37℃,此结果与乳酸乳球菌肽聚糖水解酶AcmB、AcmC的酶活性质相似。为了研究AclB在细胞分离中的作用,使用自杀性整合载体对干酪乳杆菌S1的AclB基因进行了敲除失活。结果发现敲除后的乳杆菌除了在自溶能力以及自絮凝能力上有变化外,最显著的特征是部分突变菌体拉长或者扭曲,表明AclB在细胞分裂后的分离中起着重要的作用。本文首次对乳杆菌的肽聚糖水解酶做了全面的鉴别和分析,并首次对干酪乳杆菌中的AclB酶进行了生物特性研究,为该菌株的后续应用研究奠定了基础。5.干酪乳杆菌可控裂解系统的建立及在奶酪发酵中的潜在应用干酪乳杆菌作为发酵剂或非发酵剂乳酸菌株(non-starter lactic acid bacteria,NSLAB)应用于切达奶酪等多种奶酪的发酵生产中。建立干酪乳杆菌可控裂解系统可实现胞内酶的快速释放,同时可保持发酵剂一定的活细胞数,是加快奶酪成熟的有效途径。本文选用了来自于乳酸乳球菌的AcmA与来自于粪肠球菌的AtlA两种自溶酶,以NICE系统为基础,以干酪乳杆菌为宿主分别构建了两个可控裂解体系。在nisin的诱导下,AcmA与AtlA均能够成功表达并水解细胞壁,从而裂解干酪乳杆菌细胞并释放出胞内蛋白。为了进一步验证该体系在奶酪生产中的应用潜力,我们进行了实验室规模的模拟奶酪实验,在使用AtlA裂解体系的奶酪凝乳中检测到了5倍于对照组的乳酸脱氢酶活性,这标志着更多的胞内酶在生产过程中被释放到凝乳中。此外,在整个模拟奶酪实验中,所使用的发酵菌株乳酸乳球菌的数量以及整个凝乳的pH值较对照组没有显著改变,证明奶酪性质保持了相对的稳定。该研究证实了对非发酵剂乳杆菌进行可控裂解的可行性和优势,该思路和方法应具有应用于奶酪发酵生产的潜力。