人字果药材坦控制及其体外抗氧化活性谱效关系研究

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人字果为《贵州省中药材、民族药材质量标准》修订研究新增补品种,来源于毛莨科Ranunculaceae人字果属Dichocarpum植物蕨叶入字果Dichocarpum比如dalzielii(J.R.Drummond&Hutchinson)W.T.Wang&P.K.Hsiao的干燥全草,具有清热解毒、消肿止痛等功效,用于跌打肿痛、无名肿毒等病症。目前,对人字果药材的化学成分和药理作用等现代研究几乎没有文献报道。在人字果药材质量标准研究项目的资助下,本文运用LC-MS/MS技术,结合文献分析发现人字果药材的主要化学成分为生物碱类和黄酮类化合物,并初步推断其可能含有木兰花碱、双苄基异喹啉类生物碱、海罂粟碱、山柰酚黄酮母核,且母核上含有阿拉伯糖和鼠李糖。通过与木兰花碱对照品质谱数据比对,确认人字果药材中含有木兰花碱(Ⅰ)。进一步采用制备薄层色谱法和半制备液相色谱法,并结合NMR技术,分离鉴定出化合物Olamannoside A(Ⅱ)、Kaempferol-3-O-α-L-arabinofuran-oside-7-O-α-L-rhamnopyranoside(Ⅲ)、Kaempferol-3-O-α-L-(3″-O-acetyl)-arabino-furanoside-7-O-α-L-rhamnoyranoside(Ⅳ)。以多种色谱和光谱技术相结合所分离鉴定的4个化合物,填补了人字果药材化学成分方面研究的空白,为人字果药材质量标准研究及后续的药效物质基础研究奠定了物质基础。
  按照《中国药典》中药质量标准研究制定技术要求,依照2015年版《中国药典》四部通则0212、0502、0832、2201、2302、0401、0512,采用石蜡切片、粉末制片、薄层色谱等方法对人字果药材进行性状鉴别、显微鉴别及薄层色谱鉴别研究;测定药材中浸出物、水分、总灰分和酸不溶性灰分的含量;以木兰花碱为测定指标,采用高效液相色谱法建立入字果药材中木兰花碱的含量测定方法,采用酸性染料比色法建立人字果药材中总生物碱的含量测定方法。23批人字果药材的测定结果显示:人字果药材的性状和显微特征比较稳定,可以作为其鉴别依据:薄层色谱鉴别以木兰花碱为对照品,硅胶H为固定相,以乙腈(0.1%三乙胺)-丙酮-三乙胺-水(6∶10∶3∶3)为展开剂,置紫外灯(254nm)下检视,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,方法专属性较强;醇溶性浸出物含量为36.82%~50.12%、水分含量为6.45%~8.50%、总灰分含量为9.11%~13.35%、酸不溶性灰分含量为0.27%~2.96%;HPLC含量测定法中,木兰花碱在0.2002~10.01μg范围内与峰面积值呈良好的线性关系,平均回收率为100.70%,RSD值为2.6%,人字果药材中木兰花碱的含量为0.27%-1.49%,该方法操作简便,准确可靠;酸性染料比色法测定中,术兰花碱在0.004048~0.02024mg·mL-1范围内与吸光度值是良好的线性关系,平均回收率为96.17%,RSD值为3.9%,人字果药材中以木兰花碱计总生物碱的含量为3.35%~5.98%;该研究结果为人字果药材质量标准的制定奠定了实验基础。
  按照中药指纹图谱研究技术要求,采用高效液相色谱法,建立人字果药材指纹图谱测定方法,分析测定了23批人字果药材的指纹图谱,运用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”进行相似度分析,结合主成分分析,构建人字果药材对照指纹图谱,共标定16个共有峰,并以上述分离鉴定的4个化合物为对照品,指认了4个共有峰。通过对人字果药材对照指纹图谱与同属和近缘属5个药材指纹图谱相似度分析,表明其能有效鉴别人字果药材与同属和近缘属其他药材。该方法简便可靠、重现性和专属性均较好,并可较全面地反映人字果药材中的化学成分信息,为人字果药材的质量控制研究提供理论依据。
  采用DPPH、ABTS和FRAP法,对人字果药材醇提物不同极性部位的体外抗氧化活性进行了评价,以清除DPPH和ABTS自由基的清除率及FRAP值为评价指标,结果表明三种方法均表明人字果药材的抗氧化活性部位主要为正丁醇部位、水部位及乙酸乙酯部位,其中木兰花碱(Ⅰ)、Kaempferol-3-O-α-L-arabinofuranoside-7-O-α-L-rhamnopyranoside(Ⅲ)、Kaempferol-3-O-α-L-(3″-O-acetyl)-arabinofuranoside-7-O-α-L-rhamnopyranoside(Ⅳ)均具有较强的抗氧化活性。通过对人字果药材体外抗氧化活性谱效关系的初步研究,为后续人字果药材抗氧化活性药效物质基础及其作用机制的深入研究提供了实验依据。
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