论文部分内容阅读
脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)分为原发性损伤和继发性损伤,原发性损伤是由机械性损伤所导致的,继发性损伤由一系列生化、免疫机制引起,是脊髓原发性损伤之后由于各种因素引起的脊髓再损伤级联反应,加重原发性损伤,导致更严重的临床症状。传统理论认为,抑制免疫细胞的活性能减少脊髓继发性损伤。故在SCI后的早期阶段使用甲强龙、地塞米松等减轻水肿,保护细胞膜,同时抑制免疫细胞的活性,减轻继发性损伤。然而,大量的实验证据表明:针对中枢神经系统(central nervous system, CNS)抗原的内源性自身免疫反应是有神经保护作用的。CNS抗原特异性的T细胞(比如针对髓磷脂碱性蛋白特异性T细胞)在CNS保护和修复的生理过程中起关键作用。基于先前在啮齿类动物的实验研究,Schwartz等提出了,神经变性状况下“保护性自身免疫”的概念,并将激发CNS抗原特异性T细胞免疫反应能作为一种治疗方法,减轻CNS病变,包括脊髓损伤。树突状细胞(dendritic cell, DC)是专职的抗原提呈细胞,在激发和调节适应性免疫反应中起关键作用。基于DC的免疫治疗近些年来受到大量的关注。DC已经成功的被用来产生针对肿瘤抗原特异性细胞毒T细胞,诱导免疫耐受和T细胞极化。因此,DCs作为一种疫苗能激发保护性自身免疫反应。先前,我们报道了局部或系统注射负载脊髓匀浆蛋白(homogenate protein of spinal cord,hp)的DCs(hpDC)能明显促进SCI小鼠的功能恢复。与负载髓磷脂碱性蛋白的DC相比,负载脊髓匀浆蛋白有更好的疗效。吴茱萸碱(Evodiamine, EVO),是一种从吴茱萸中提取的生物碱。它有多种生物作用,比如,抗肿瘤生长和血管生成、抗炎等作用。本课题组研究发现,在体外EVO能上调成熟DC诱导抗原特异性T细胞反应的能力。那么,吴茱萸碱刺激的负载脊髓匀浆蛋白的DC(hpDCevo)能否比负载脊髓匀浆蛋白的DC(hpDC)激发更强的针对CNS抗原特异性T淋巴细胞免疫反应,并进一步促进SCI动物的功能恢复,目前国内外尚未见报道。材料与方法:本文首先通过腹腔注射PBS、负载脊髓匀浆蛋白的DC、吴茱萸碱刺激的负载脊髓匀浆蛋白的DC治疗T9脊髓损伤动物,采用BMS评分、组织病理学检查评估吴茱萸碱刺激的负载脊髓匀浆蛋白的DC能否促进SCI小鼠后肢功能恢复。后采用ELISA、MTT、免疫荧光实验检测小鼠脾脏T淋巴细胞的增殖活性,Th细胞分泌的细胞因子IFN-γ和IL-4探讨Th细胞极性的变化,以及神经营养因子BDNF、NT-3和神经干细胞标记物Nestin,轴突标记物NF200的表达。进一步探讨吴茱萸碱刺激的负载脊髓匀浆蛋白的DC促进SCI小鼠后肢功能恢复的可能机制。结果:1.小鼠在建模后均出现完全性截瘫,2w左右BMS评分逐渐恢复。其中,吴茱萸碱刺激的负载脊髓匀浆蛋白的DC(hpDCevo)组小鼠恢复最快,于28dpi进入平台期,BMS评分高达6.29±0.25,最终达到6.92±0.2,显著高于负载脊髓匀浆蛋白的DC组(6.00±2.7)和PBS组(3.75±0.27)(p<0.05)。表明腹腔注射吴茱萸碱刺激的负载脊髓匀浆蛋白的DC能促进脊髓损伤小鼠后肢运动功能的恢复。2.病理组织学检测显示,吴茱萸碱刺激的负载脊髓匀浆蛋白的DC(hpDCevo)组的损伤区面积(1.93±0.16mm2)和局部空洞范围(0.22±0.01mm2)与负载脊髓匀浆蛋白的DC(hpDC)组的损伤区面积(2.18±0.12mm2)和局部空洞范围(0.25±0.02mm2)比较均有显著统计学差异(p<0.05)。表明腹腔注射吴茱萸碱刺激的负载脊髓匀浆蛋白的DC明显减少了脊髓损伤区面积和空洞面积。3.体外MTT实验证实,吴茱萸碱、DC、吴茱萸碱刺激的DC均不能促进同种系动物T淋巴细胞增殖;但是,负载卵清蛋白的DC(ovaDC)和吴茱萸碱刺激的负载卵清蛋白的DC(ovaDCevo)均能促进同种系动物T淋巴细胞增殖,OD值分别达到0.62±0.03、0.99±0.04,但是吴茱萸碱刺激的负载卵清蛋白的DC比负载卵清蛋白的DC激发了更加强烈的T细胞增殖(p<0.05)。表明吴茱萸碱能够上调负载抗原的DC刺激T细胞增殖的能力。4.体外实验证实,腹腔注射吴茱萸碱刺激的负载脊髓匀浆蛋白的DC(hpDCevo)组脾脏T细胞比负载脊髓匀浆蛋白的DC(hpDC)的脾脏T细胞有更强的增殖能力(OD值分别为0.33±0.03,0.25±0.04)(p<0.05)。同时,吴茱萸碱刺激的负载脊髓匀浆蛋白的DC组损伤局部的T细胞数量(673.33±167.17/mm2)明显高于负载脊髓匀浆蛋白的DC组(500±146.42/mm2)(p<0.05)。提示腹腔注射吴茱萸碱刺激的负载脊髓匀浆蛋白的DC激发了更加强烈的T细胞免疫应答。5.体外实验证实,腹腔注射吴茱萸碱刺激的负载脊髓匀浆蛋白的DC(hpDCevo)组的脾脏T细胞分泌的IFN-γ明显高于负载脊髓匀浆蛋白的DC(hpDC)组,并且IFN-γ浓度随时间延长逐渐增加。体外培养72小时,两组的IFN-γ浓度分别为2792.54±162.99 pg/ml,932.94±60.24pg/ml(p<0.05)。腹腔注射吴茱萸碱刺激的负载脊髓匀浆蛋白的DC(hpDCevo)损伤局部IFN-γ浓度(1882.85±50.67ng/g)明显高于负载脊髓匀浆蛋白的DC(hpDC)组(970.56±19.9 4ng/g)(p<0.05),而各组IL-4在体内、体外实验中均无统计学差异。提示,腹腔注射茱萸碱刺激的负载脊髓匀浆蛋白的DC(hpDCevo)激发了以Th1为主的免疫应答。6.体外实验证实,腹腔注射吴茱萸碱刺激的负载脊髓匀浆蛋白的DC(hpDCevo)组的脾脏T细胞分泌的BDNF(393.80±48.99 pg/ml)和NT-3(32.17±2.48 pg/ml)的浓度明显高于负载脊髓匀浆蛋白的DC(hpDC)组(BDNF:300.10±14.34 pg/ml,NT-3:7.95±4.08 pg/ml)(p<0.05)。吴茱萸碱刺激的负载脊髓匀浆蛋白的DC(hpDCevo)组损伤局部BDNF(27.71±0.35ng/g)和NT-3(1.47±0.11ng/g)浓度也明显高于负载脊髓匀浆蛋白的DC(hpDC)组(BDNF:25.39±0.55 ng/g,NT-3:0.98±0.16 ng/g)(p<0.05)7.IF染色发现,吴茱萸碱刺激的负载脊髓匀浆蛋白的(hpDCevo)DC组脊髓损伤区的Nestin+细胞(187.5±18.73/mm2)和NF200+细胞(88±12.9/mm2)数量均明显多于负载脊髓匀浆蛋白的DC(hpDC)组(Nestin+细胞: 101.75±15.44/mm2, NF200+细胞:61.75±20.12/mm2)(p<0.01)。结论:1.本实验首次证明,腹腔注射吴茱萸碱刺激的负载脊髓匀浆蛋白的DC比负载脊髓匀浆蛋白的DC明显促进了T9 SCI小鼠的后肢运动功能的恢复,减少了损伤区面积。说明吴茱萸碱增强了负载脊髓匀浆蛋白的DC的神经保护作用。2.吴茱萸碱可上调负载抗原的DC激发T细胞免疫应答的能力。3.腹腔注射吴茱萸碱刺激的负载脊髓匀浆蛋白的DC促进Th0向Th1偏移。4.腹腔注射吴茱萸碱刺激的负载脊髓匀浆蛋白的DC比负载脊髓匀浆蛋白的DC明显促进损伤局部神经营养因子BDNF和NT-3的表达,并上调Nestin+细胞和NF200+细胞的数量。这表明hpDCevo可诱导神经干细胞/前体细胞向神经元分化,或通过促进T细胞分泌神经营养因子。从而促进脊髓损伤小鼠的后肢运动功能的恢复。