蛋白质分子及其组分辐射氧化损伤的生物光谱学分析

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越来越多的研究表明蛋白质辐射氧化损伤与生物体的辐射效应密切相关。由于光谱分析技术的诸多优点,其在蛋白质研究中一直发挥着重要作用。在本研究中,我们综合利用紫外-可见吸收光谱、荧光光谱、红外光谱、拉曼光谱,结合高效液相色谱等分析化学手段,对蛋白质分子及其组分辐射氧化损伤进行了光谱学定量分析,对其主要氧化损伤产物进行了鉴定,并对其氧化损伤的机理进行了探讨。这项工作为生物光谱技术在蛋白质辐射氧化损伤分析中的应用做了有益的拓展,为分析蛋白质辐射氧化损伤提供了有用的光谱学数据和信息,促进了我们对这一生化过程的理解。  论文主要研究结果总结如下:  1、氨基酸的辐射氧化损伤研究。我们选择氧化敏感型的苯丙氨酸、半胱氨酸作为研究对象,经低温常压气-液界面等离子体放电处理之后,综合利用紫外-可见吸收光谱、茚三酮反应、荧光光谱、高效液相色谱等多种分析技术对样品的辐射氧化损伤进行了定量分析。经研究发现,样品呈指数损伤。与其他光谱学方法相比,荧光光谱分析法可实现样品损伤的准确定量分析。羟基自由基、水合电子等活性基团在样品损伤中起着重要作用。利用高效液相色谱及红外光谱技术对主要氧化损伤产物进行了鉴定。另外,利用“原位”红外光谱技术对固体氨基酸样品的低能离子注入损伤也进行了定量分析,经研究发现不同氨基酸样品的辐射敏感性不同,且不同的注入离子种类引起的损伤效应不同。  2、还原型谷胱甘肽辐射氧化损伤的拉曼光谱研究。在寡肽的辐射氧化损伤研究中,我们选择具有重要生理功能的谷胱甘肽作为研究对象。利用还原型谷胱甘肽侧链巯基伸缩振动拉曼峰(2567 cm-1)强度及主要氧化产物氧化型谷胱甘肽中二硫键伸缩振动拉曼峰(508 cm-1)强度作为分析指标,对还原型谷胱甘肽的氧化损伤及产物生成分别进行了定量分析。经研究证实,还原型谷胱甘肽呈指数损伤,其侧链巯基是主要损伤位点。在损伤的还原型谷胱甘肽中,约30-40%转变成为氧化型,其余转变为硫化氢等其它产物。  3、蛋白质分子辐射氧化损伤的光谱分析。在蛋白质的辐射氧化损伤研究中,我们选择应用广泛的辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)作为研究对象。实验结果表明,等离子体放电可引起HRP失活、辅基Heme损伤、Fe的释放,且酶失活趋势与Heme损伤趋势相同。以Heme损伤产物荧光强度作为分析指标证实Heme损伤主要是由于等离子体放电生成的H2O2引起的。羟基自由基等一级自由基及放电生成的紫外辐射可促进这一反应过程。  4、等离子体放电与电子辐射的比较研究。为了比较等离子体放电与其他辐射作用的区别,我们对等离子体放电和电子辐射两种条件下生成的羟基自由基、超氧阴离子及H2O2含量分别进行相对定量分析。与电子辐射相比,等离子体放电条件下溶液中生成的H2O2相对含量远大于前者,并且二者对酶的作用方式也不同。电子辐射条件下主要由生成的各种一级自由基作用于辣根过氧化物酶的肽链部分从而引起酶的失活,而等离子体放电条件下结果主要表现为生成的H2O2和各种自由基共同作用于酶的辅基Heme和肽链。  5、等离子体放电的应用研究。除了各种氧化型基团,等离子体放电还可引起溶液中生成多种还原型基团。基于利用生成的还原型基团,我们利用该装置成功还原和去除溶液中Cr(Ⅵ),并考察了溶液pH、羟基自由基清除剂乙醇对Cr(Ⅵ)还原和去除效率的影响。在pH>3.0时,随着pH的升高,Cr(Ⅵ)的还原效率增大。pH=2.0时,Cr(Ⅵ)还原效率最高。乙醇作为羟基自由基清除剂,不仅可以促进Cr(Ⅵ)的还原,还可促进Cr(Ⅵ)最终主要以Cr(OH)3的形式沉淀析出。在pH=6.0-7.0范围内,Cr(Ⅵ)去除效率最高。
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