目的:耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)可引起广泛感染,通常涉及呼吸道、皮肤和软组织、关节和留置导管或假体装置相关的感染,至今仍是全球主要的医疗保健问题。特别是MRSA引起的肺部感染表现出高发病率,同时伴随多部位感染转移和复杂性感染。然而,推荐用于治疗MRSA的药物面临很多局限性,比如杀菌活性作用缓慢,组织渗透能力差,耐药性的不断增加以及临床治疗的频频失败。细菌分裂对于微生物的生长、繁殖、衰亡有重要影响。二分裂是细菌繁殖的主要方式,将母细胞的遗传信息等物质分裂进入两个子细胞。抗菌药物通过抑制细胞壁的合成、改变膜的通透性和阻碍核酸及蛋白质的合成等环节,起到抑制细菌生长繁殖或者杀灭细菌的作用。随着科学技术的革新,球状细菌分裂机制也得到了较好的研究,特别是细菌分裂蛋白和“踏车”运动的深入阐述为抗生素的开发寻找新的靶点提供了思路。中药现在多被认为是西药的替代和补充疗法。经历成百上千年时间检验,通过无数体内测试的中药不应局限于此。根据世界卫生组织在两千年初的统计,全球约近80%的人口仍在使用天然药物的治疗。中药的抗菌活性不断被证实,提示在治疗细菌感染方面,中药是一个丰富的资源库,亟待我们研究发掘。痰热清注射液(TanReQing,TRQ)是黄芩、熊胆粉、山羊角、金银花、连翘组成的中药复方制剂,治疗风温肺热病、痰热阻肺证,对支气管感染和肺部感染疗效显著,对慢性阻塞性肺疾病急性加重期也有治疗作用。虽然TRQ的抗菌活性被证实,但其作用机制尚未被揭示。在我们的前期工作中发现TRQ不同于抗生素,具有很好的抗生物膜活性。本文以TRQ为研究对象,通过其对MRSA分裂的影响进行探讨,分别从MRSA细菌分裂的形态学、细菌分裂蛋白FtsZ的调控、细胞壁肽聚糖合成与水解进行阐述。方法:1.扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscope,SEM)观察 TRQ 对 MRSA分裂的形态影响将振摇过夜的细菌接种于24孔板中,底部铺设无菌玻璃片。加入药物,菌液终浓度OD600=0.05,37℃培养24h。取出细菌附着的玻璃片,分别使用戊二醛、锇酸对细菌进行固定,梯度脱水处理,真空冷冻干燥至完全挥干,喷金并在SEM下观察拍照。使用Image J软件对菌体长度进行测量。2.结构光照明超高分辨率荧光显微镜(Structured Illumination Microscopy,SIM)观察TRQ对MRSA分裂周期的影响将菌液以1:1000的比例稀释,培养5小时,重复3次,保证细菌处于对数分裂期。加入药物,使得菌液终浓度OD600=0.05,37℃培养0.5小时。加入染料尼罗红和WGA-488进行染色。配制琼脂糖用于细菌固定,使用SIM进行观察。将数据在Imaris软件中进行处理。3.蛋白免疫印迹法(Western blot,WB)检测TRQ对MRSA分裂蛋白FtsZ的影响按照实验2中的方法进行细菌培养和药物干预。离心收集菌体,加入蛋白抽提液进行提取,使用BCA试剂盒测定总蛋白含量,按计算结果上样,保证每孔的总蛋白含量一致。进行SDS-PAGE电泳,转膜,脱脂奶粉封闭,一抗孵育4℃过夜,漂洗后孵育二抗,加入ECL化学发光液,使用ChemiDocTM成像系统进行检测。4.酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)检测 TRQ对MRSA分裂PG合成表达量的影响按照实验2中的方法进行细菌培养和药物干预。收集菌体后,加入超纯水,使用细胞破碎仪破碎细胞壁,进行肽聚糖提取。按照ELISA试剂盒说明书的步骤进行操作,并使用酶标仪进行检测。5.Real Time PCR检测TRQ对MRSA分裂相关基因的影响设计并合成目的基因的引物。按照实验2中的方法进行细菌培养和药物干预。加入液氮研磨破碎细菌,使用试剂盒提取细菌总RNA。进行变性琼脂糖凝胶电泳,紫外透射光下检测RNA质量。将RNA逆转录合成cDNA,进行Real Time PCR,数据采用2-ΔΔCT法进行处理。结果:1.TRQ可明显抑制细菌的分裂。TRQ组未分裂细菌的长度大于空白组和对照组。形态学上,可观察到单个菌体的异常增大,或者细菌呈现初始的隔膜内陷,却无法分裂的多胞体现象。同时TRQ还可以引起细菌旧分裂线的位置产生偏移,以及使表面变得十分粗糙。2.TRQ可以通过破坏分裂隔膜的形成,使细菌无法进行分裂。与空白组和对照组可形成赤道样Z环的成熟分裂隔膜不同,TRQ组观察到大量细丝状的膜散布于细胞膜上和膜内,阻碍分裂位点环状结构的形成,影响细菌分裂的进程。同时根据细菌所处分裂周期的阶段进行分选,发现TRQ组近80%的细胞处于细菌分裂2期,即正在进行隔膜合成。空白组和对照组则大多处于分裂3期,即具有成熟的完整隔膜,菌体显著伸长,以准备分裂成两个子细胞。3.TRQ可通过上调分裂蛋白FtsZ的量,影响细菌分裂的进行。与空白组和对照组相比,TRQ增加了 MRSA内FtsZ蛋白的表达水平,同时呈现剂量依赖性。FtsZ蛋白表达过量,则会稀释与之结合的其他分裂蛋白的含量,阻碍分裂复合物的形成。此外,还可以减少其他分裂蛋白相互反应的空间,增加反应难度,从而抑制细菌分裂。4.TRQ可以阻碍肽聚糖的水解,抑制细菌分裂。与空白组和对照组相比,TRQ增加了 MRSA内的肽聚糖含量。肽聚糖含量随TRQ浓度增加而增加。肽聚糖在菌体内可进行合成和水解。由于肽聚糖的水解会使得菌体表面光滑,结合SEM观察的表面粗糙的现象,推测TRQ可以抑制肽聚糖的水解。而对肽聚糖合成的影响仍需进一步研究。5.TRQ可抑制Z环形成和稳定基因GpsB以及锚定蛋白基因FtsA的转录,从而使得FtsZ形成Z环、锚定细胞膜的过程受到抑制,难以形成成熟的分裂隔膜。同时TRQ还可以通过抑制肽聚糖水解酶基因sle1的转录,使得肽聚糖在MRSA菌体内累积。结论:TRQ可以增加分裂蛋白FtsZ的含量,同时抑制锚定蛋白FtsA和Z环稳定蛋白GpsB的合成,使得MRSA无法形成成熟分裂隔膜,细丝状散在分布于膜内和膜上,细菌分裂的进程受到阻滞。同时TRQ还可以抑制肽聚糖的水解,造成即使形成成熟隔膜的细菌也无法完全分离,形成多胞体,分裂线的位置产生偏移。长时间无法分裂,可能造成细菌表面结构粗糙,菌体长度的增大。综上所述,TRQ可以从多个靶点协同抑制MRSA的分裂,相关组分的活性及机制需进一步研究。