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一、目的HMGB1可以通过多种途径促进肿瘤细胞迁移、侵袭及转移,虽然有研究证明E钙粘蛋白参与HMGB1介导的肿瘤进展,但粘附连接复合物的另一成员p120连环蛋白在其中是否发挥作用还鲜见报道。本实验主要研究HMGB1是否可以通过下调粘附连接蛋白E钙粘蛋白及p120连环蛋白的表达促进结肠癌细胞的迁移,从而为结肠癌的治疗提供新思路。二、方法用重组人HMGB1刺激培养的人结肠癌细胞(Lo Vo),分别用细胞划痕实验、Transwell迁移实验及软琼脂粘附实验检测细胞的迁移及粘附能力;Western blot及RT-PCR检测HMGB1刺激24 h后,培养细胞内E-cad及p120表达量的变化;免疫荧光检测E-cad及p120在细胞中定位的变化;提前用Src抑制剂PP2处理细胞一小时,然后给予HMGB1刺激,观察PP2对HMGB1介导的细胞迁移及E-cad、p120表达的影响,从而间接证明HMGB1是否通过活化非受体型酪氨酸激酶Src发挥作用。三、实验结果1.HMGB1对细胞迁移能力的影响细胞划痕实验结果示:与对照组相比,HMGB1显著促进肿瘤细胞向划痕区域迁移。Transwell迁移实验示:HMGB1刺激组中穿过膜的细胞数明显多于对照组,差异具有统计学意义。2.HMGB1对细胞间粘附的影响对照组细胞易聚集形成较大细胞团,镜下单个细胞少见;而HMGB1刺激组细胞间连接松散,细胞多单个分散存在。软琼脂聚集实验结果显示两组差异具有统计学意义。3.HMGB1对E-cad及p120表达的影响1)给予人结肠癌细胞不同浓度的HMGB1(40、200、1000 ng/ml)刺激24h,结果发现与对照组相比,实验组细胞内E-cad、p120蛋白表达减少,且呈浓度依赖性。2)HMGB1刺激人结肠癌细胞不同时间(6 h、12 h、24 h)后,与对照组(0h)相比,培养细胞中E-cad、p120蛋白表达减少,且呈时间依赖性。RT-PCR检测HMGB1处理细胞0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h后p120 m RNA水平,结果示:HMGB1刺激不同时间,细胞中p120 m RNA表达无明显变化。3)免疫荧光示:在对照组Lo Vo细胞中,E-cad、p120共定位在细胞间连接处,呈完整连续的线状;HMGB1刺激后E-cad、p120在细胞膜上表达缺失,表现为胞浆弱荧光强度。4.Src抑制剂PP2对细胞迁移及E-cad、p120表达的影响PP2(20μM)预处理细胞1 h,可以抑制细胞迁移,并恢复E-cad、p120蛋白的表达及其在细胞连接处的定位。四、实验结论HMGB1可能通过活化Src下调人结肠癌细胞E-cad及p120的表达,降低肿瘤细胞间的粘附,从而促进肿瘤细胞的迁移。