温度作为影响生物分布的重要因素之一,直接决定了生物体的生理特征和行为。鱼类作为最广泛分布的脊椎动物,其如何来适应温度变化一直以来是环境生物学的一个研究热点。对斑马鱼和罗非鱼进行低温胁迫过程中的研究发现,鳃是最敏感的组织,最容易受到损伤,8℃低温处理6h和12h有大量高表达的差异基因参与到凋亡信号通路中。对转录组数据进行分析发现,在鳃细胞凋亡过程中,骨形成蛋白(bone morphogenetic protein 10,bmp10)和双特异性磷酸酶(dual-specificity phosphatase 1,dusp1)在两种鱼的表达模式不同,并在凋亡信号通路中起重要调控作用。基于这些研究,阐明bmp10,dusp1在斑马鱼分子生物学过程具有重要意义,将有利于我们进一步了解鱼类低温应激过程中的适应机制。Bmp10是与心脏发育息息相关的BMP家族成员,在心脏、神经和软骨发育过程中具有重要作用。在哺乳动物中,初步研究发现,bmp10首先在小鼠胚胎心脏中表达,突变纯合体小鼠,会导致心肌发育不全,胚胎致死,预示着bmp10在心脏发育过程中具有重要调控功能。但是在斑马鱼胚胎和成体发育过程中的研究仍不清楚。Dusp1属于双特异性磷酸酶,是MAPK家族蛋白的负调控基因,参与大量的生理学活性,包括细胞信号传递、软骨细胞生长、细胞新陈代谢过程等,抑制其表达或者诱导高表达都有可能导致细胞发生凋亡。斑马鱼作为模式生物,具有个体小,容易饲养,并且基因组全序列已经被公布等生物学优点,生长速度快,使得斑马鱼成为我们研究鱼类生物学过程和低温诱导的基因调控机制方面的最佳实验材料。为了揭示bmp10,dusp1与斑马鱼鳃细胞凋亡之间的关系,本研究首先利用CRISPR/Cas9技术在斑马鱼胚胎发育一细胞期对bmp10,dusp1进行敲除,经TUNEL凋亡检测鳃细胞凋亡情况,并进一步用HE检测病理变化;其次在斑马鱼胚胎纤维样ZF4细胞中进行体外验证,对dusp1进行敲降,检测细胞凋亡数。结果发现,bmp10敲除型斑马鱼心肌发育异常,鳃细胞发生水肿,低温应激下,加速心肌细胞坏死,鳃细胞发生严重水肿,导致鳃细胞凋亡。分析发现bmp10敲除位点在保守区域,说明在斑马鱼进化过程中具有重要调控作用,对bmp10进行敲除会影响心脏发育,进而在低温应激下会加速鳃细胞发生凋亡,水肿现象。Dusp1纯合突变体斑马鱼,低温下,鳃细胞凋亡数显著增加,但是鳃小片未检测到明显病理变化。Dusp1敲降型ZF4细胞低温下会促进细胞发生凋亡。分析发现dusp1序列未检测到保守区域,敲除dusp1会出现其他基因的相互协同作用,因此dusp1敲除型斑马鱼表型不明显。总之,本研究证明了bmp10,dusp1参与鱼类低温应激过程,在细胞凋亡信号通路中起到重要调控作用,敲降或敲除bmp10,dusp1,基因功能缺失,都会诱导细胞发生凋亡。Bmp10在斑马鱼心脏发育过程中具有重要的调控作用。本研究为后续研究鱼类内源性基因表达和发生学变化分子机制奠定了基础。