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低磷胁迫是限制作物生长的重要因素之一,植物在长期进化过程中形成了一系列适应低磷胁迫的反应机制.目前为止,植物耐低磷胁迫的分子机制在拟南芥、水稻、苜蓿等模式植物上的研究已有了一定的基础,但是大豆[Glycine max(L.)Merr]在这方面的研究却非常有限,主要仍集中在表型和生理分析上,大豆参与磷信号调控的相关基因还未见报道.大豆是世界范围内重要的粮油作物,为人类和动物提供了丰富的蛋白质和油料.低磷胁迫极大地限制了我国南方酸性红壤的大豆生产.为了深入了解磷高效品种耐低磷的作用机制,阐明大豆对低磷胁迫适应性反应的基因调控网络,本研究以具有良好根构型的磷高效基因型BX10为材料,利用抑制缩减杂交技术分别构建了大豆根部短期和长期耐低磷胁迫的cDNA文库RS和RL,获得了135个差异表达片段,进而从长期库RL中选取与根发育相关、编码β-扩张蛋白的候选基因GmEXPB2进行具体的功能分析,研究其在根系生长发育中所起的作用及对低磷胁迫的适应性机制,以进一步研究缺磷信号对植物根系发育的调控模式.本研究获得的主要研究结果如下:
(1)以大豆根部低磷处理(0.2 mol/L KH2PO4)cDNA为 Tester,高磷处理(1000mol/L KH2PO4) cDNA为Driver,构建了短期(0.5-12小时)和长期(3-12天)低磷诱导的两个缩减文库RS和RL,分别从中选取了75和60个差异表达片段进行测序分析,同时运用定量PCR的方法对其中八个候选基因的表达模式进行进一步验证.根据它们与已知功能基因的相似性,将这135个克隆分为五个功能组,包括了代谢、遗传信息、环境互作、发育和未知功能组.本研究发现,根部低磷诱导的短期和长期库中,候选基因没有重叠,而且各功能组所占的比例存在差异.在短期库中,代谢、遗传信息、环境互作、发育和未知功能组所占比例依次是31％、16％、25％、7％和21％；但在长期库中,它们所占比例依次为23％、33％、12％、10％和22％.由此推测,转录水平上代谢相关的基因可能在大豆对缺磷的适应机制中起着重要作用,植株通过诱导或上调表达代谢类基因引起体内代谢途径的改变,从而作用于生长发育等表型变化:根系发育对缺磷的适应性反应可能是与其它一些代谢途径协同作用的.
(2) 为验证上述假设,从长期库RL中选取了发育类候选基因RL42,研究其表达和调控模式.通过5和3RACE(Rapid amplification of 5and 3cDNA ends)技术,获得了该片段的全长cDNA序列,利用生物信息学方法初步推断该基因为β-扩张蛋白编码基因,其ORF具有β-扩张蛋白特有的结合区域,色氨酸(W)、半胱氨酸域(C)和组氨酸(His-Phe-Asp,HFD)域的分布完全符合β-扩张蛋白的结构特征.根据国际通用的命名法则,将该基因命名为GmEXPB2,并将cDNA序列递交到GenBank上,注册号为EU362626.进而根据其5-UTR序列设计引物,利用TAIL-PCR技术获得GmEXPB2转录起始上游1.5 kb的启动子序列.通过TSSP和PLACE等启动子分析工具,推测启动子的TATA盒位于转录起始上游-21至-29的位置,同时发现启动子上有一系列受激素调控的相关元件,其中有4个假定的赤霉素响应元件,2个假定的细胞分裂素响应元件,1个假定的乙烯响应元件.在-38至-43位置发现一个可能与缺磷信号有关的PHO4结合元件.
(3)利用全长ORF融合GFP转化洋葱表皮细胞,确定GmEXPB2属于分泌蛋白,定位于细胞壁,符合生物信息学预测的结果.
(4)实时荧光定量PCR结果显示了GmEXPB2基因表达的组织特异性及对磷信号的反应模式.GmEXPB2基因在根部强表达,在花器官有低表达量,叶部则不表达.分析GmEXPB2在磷高效基因型BX10和磷低效基因型BD2的表达模式,发现在两个基因型中,缺磷处理都可显著增强GmEXPB2在根和下胚轴的表达量,并且在磷高效基因型中的表达量明显高于磷低效基因型.
(5)利用翻译起始上游500bp的启动子区段转化大豆毛状根,结果显示只能在缺磷处理时检测到GUS染色,说明此区段是缺磷特异反应的.在低磷处理下,发现与其它扩张蛋白一致,GmEXPB2基因在根部的表达模式有明显的细胞特异性,在初级毛根的成熟根段,GmEXPB2基因主要在中柱的韧皮部和中柱鞘细胞表达;在初级毛根的幼嫩根段和次级毛根,除了在中柱表达外,在皮层细胞也有一定表达量。可见,GmEXPB2基因与侧根的发生发育密切相关.同时,根尖的切片结果显示了GmEXPB2基因在根冠的特异表达,暗示其与根系发育的密切关系.
(6)通过35S驱动的过量表达和干涉GmEXPB2基因转毛状根得到GmEXPB2增强表达和沉默的转基因根系,发现转基因毛根的根尖表现不正常的发育状态.过表达毛根的伸长区局部横向扩张,生成形似"鸭头"状的根尖;而干涉毛根的根冠和分生区横向收缩,生成形似"滴管"状的根尖,由此可见GmEXPB2作用于根尖的形态建成.毛根中未能发现侧根发育等根性状表型的差异,但切片结果显示中柱细胞的形态受到较大影响.过表达毛根的中柱鞘细胞比对照毛根明显扩张,而干涉毛根的相对缩小.
(7)进一步在拟南芥中异源表达GmEXPB2,研究其在整株水平对根系发育和磷信号的作用模式.结果显示,在正常供磷条件下,转基因植株的主根和侧根生长与野生型差异不大;而在缺磷和缺糖条件下,转基因植株的主根长、侧根长和侧根数目都有显著增加.结合上面大豆毛状根表型分析推断,GmEXPB2参与了根系发育对缺磷的适应性反应,在体内磷供应不足的条件下,能刺激主根、侧根继续伸长和侧根原基的形成,维持根系正常生长.
(8)观察GmEXPB2异源表达对拟南芥其它性状的影响,发现35S驱动的过表达能明显增大叶面积,这可能与扩张蛋白的扩张作用相关.另外,转基因拟南芥的开花时期明显比野生型延迟,鉴于GmEXPB2在花器官有一定表达丰度,初步推测GmEXPB2同时作用于花发育.
综上所述,本研究克隆了大豆上编码β-扩张蛋白的新基因GmEXPB2,通过分析其表达模式和作用功能,发现GmEXPB2主要在根部表达,并受磷信号调控;正常生长条件下,GmEXPB2主要作用于根部中柱和根冠的发育;缺磷胁迫条件下,GmEXPB2促进主根和侧根发育对缺磷的适应性反应,是一类有重要生物学功能的细胞壁蛋白.