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背景：肝癌是一种常见的恶性肿瘤,而血红素加氧酶(HO-1)是肿瘤细胞中一类保护细胞对抗氧化损伤的酶,可被众多因素诱导表达升高,转录因子BTB-CNC同源异构体1(bach1)属于CNC转录因子家族,能够负性调节HO-1的表达,降低肝癌细胞中HO-1的高表达对细胞产生的保护作用。鉴于HO-1在肿瘤治疗中所起的保护作用,我们试图建立一种系统来提高Bach1的表达从而达到抑制HO-1的表达的目的,Tet-on基因表达系统是一种可控的高效表达系统,该系统包括调节质粒和反应质粒两部分,控制调节质粒的是四环素(Te)及其衍生物doxycylin。然后通过甘草酸干预细胞,检验当肿瘤细胞中HO-1表达降低时,肿瘤细胞的凋亡情况。
目的：构建盐酸多西环素表达调控的真核表达载体pBI-EGFP-bach1,并检测bach1和HO-1的表达;MTT检测肝癌细胞对甘草酸的药物敏感性及药物作用下HO-1的表达情况;DNA Ladder与免疫细胞化学检测抑制HO-1的表达对细胞凋亡的影响。
方法：⑴将质粒pQE30-bach1用PCR法进行扩增,将质粒PBI-EGFP及PCR法扩增的Bach1用NheI和MhI进行双酶切,回收大约2170bp大小片段,构建重组质粒PBI-EGFP-bach1,双酶切鉴定；⑵利用脂质体法将Tet-On质粒和重组质粒pBI-EGFP-Bach1双转染人肝癌SMMC-7721细胞,48h后RT-PCR法检测Bach1以及HO-1在细胞内的表达情况,确定盐酸多西环素的浓度；⑶RT-PCR检测肝癌细胞SMMC-7721加入甘草酸48h后HO-1的表达；⑷用MTT法检测肝癌细胞SMMC-7721对甘草酸的药物敏感性,计算IC50；⑸DNALadder检测抑制HO-1的表达对细胞凋亡的影响；⑹通过免疫细胞化学技术检测转染细胞中凋亡相关蛋白Caspase-3的表达情况。
结果：NheI和MluI双酶切重组质粒pBI-EGFP-Bach1,凝胶电泳及PCR产物测序显示重组质粒构建成功;Tet-on与重组质粒pBI-EGFP-Bach1双转染细胞48h,经RT-PCR检测显示双转染组bach1表达显著升高,同时相应的抑制了HO-1的表达;设置不同浓度的盐酸多西环素,确定最佳诱导浓度为3000ng/ml:MTT检测甘草酸的IC50为3.27±0.037mmol/L,RT-PCR检测甘草酸药物组HO-1的表达随甘草酸浓度的增高而受到抑制;与正常空白对照组相比,转染Tet-on与重组质粒pBI-EGFP-Bach1+1.5mmol/L甘草酸组及转染Tet-on与重组质粒pBI-EGFP-Bach1组出现明显的DNA ladder,而1.5mmol/L甘草酸组DNA ladder不明显;免疫细胞化学显示转染组细胞中凋亡相关蛋白Caspase-3的表达升高。
结论：①本实验成功地构建了真核表达载体pBI-EGFP-Bach1,并证实其能在人肝癌SMMC7721细胞中的大量表达bach1基因,并相应的抑制了HO-1的表达；②RT-PCR证实了甘草酸可抑制HO-1的表达,而且具有一定的浓度效应,并通过MTT检测出甘草酸对人肝癌细胞的IC50为3.27±0.037mmol/L；③DNA Ladder显示抑制HO-1的表达,细胞产生的凋亡条带明显；④免疫细胞化学表明抑制HO-1的表达,细胞凋亡相关蛋白caspase3的表达升高。