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从分泌抗HIV-1gp120单克隆抗体的杂交瘤细胞102中，提取出mRNA，在反转录酶的作用下，合成cDNA，经PCR扩增，分别获得抗HIV-1gp120蛋白单克隆抗体的轻、重链可变区基因V_L和V_H。在该基因中加入连接肽基因后，经进一步PCR扩增、组装合成出单链抗体ScFv（single chain antibody）基因，将该基因克隆入pGEM-T载体后，进行了核苷酸序列分析测定。测序结果表明，获得的单克隆抗体轻、重链可变区基因V_L和V_H符合小鼠抗体可变区基因特征，为功能性重排的鼠抗体可变区基因序列，分离得到的单链抗体基因ScFv由重链可变区基因V_H-连接肽基因-轻链可变区V_L基因构成，这种构成模式较V_L-Linker-V_H基因结构具有更强的抗体亲和活性。ScFv基因全长为705bp，其中V_H基因为336bp，编码112个氨基酸，V_L基因全长为324bp，编码108个氨基酸。 将获得的ScFv基因分别代替绿脓杆菌外毒素PE和白喉毒素DT的受体结合区，制备出重组毒素基因ScFv-PE和DT-ScFv，利用原核表达载体pET28，构建了用于表达抗HIV-1gp120蛋白的单链抗体及重组毒素的原核表达质粒pET28-ScFv、pET28-ScFv-PE、pET28-DT-ScFv，上述质粒转化受体菌BL21（DE3）后，经IPTG诱导，成功地表达了目的蛋白。其中抗HIV-1 gp120 ScFv的表达量占菌体蛋白总量的51％以上，而重组毒素ScFv-PE和DT-ScFv的表达量分别占菌体蛋白总量的28％和26％左右，三种表达产物均以包涵体的形式存在，三种蛋白的包涵体经8M脲变性处理后，分别进行了复性处理，利用Ni-NTA金属螯合层析法对表达产物进行了纯化，三种目的蛋白的纯度均超过了85％以上。 为了便于对表达的单链抗体及重组毒素进行检测，实验中利用杆状病毒表达载体Bac-to-Bac系统，对中国流行株B亚型HIV-1Gag-Env融合蛋白进行了表达，首先构建了杆状病毒重组表达质粒pfast-GE，该质 博士学位快不 中文自县一粒经转座和加压筛选后，分离出重组杆状病毒基因组穿梭质粒Bacmid，将其转染SN昆虫细胞后，筛选出稳定表达中国流行株HIV上－gpl 20蛋白的重组杆状病毒。利用重组杆状病毒的表达产物，对制备的单链抗体及重组毒素进行检测发现，得到的单链抗体及重组毒素具有良好的抗原结合活性。 为进一步验证重组毒素对靶细胞的杀伤作用，本实验构建了表达中国流行株HIV1 蛋白的真核重组表达质粒pIRgp和pCDgp，该重组质粒转染Hela细胞后，经G418加压筛选，得到稳定表达HIV1gpl20蛋臼的靶细胞株Hela－gp。用此细胞模型对制各的重组毒素进行测试发现，重组毒素ScFvPE对Hela苫p细胞表现出良好的细胞毒性作用，在此基础上，将重组毒素作用于B亚型HIVJ感染的MT4淋巴细胞，证明SCFV－PE可对HIV－l感染的靶细胞起到特异性杀伤破坏作用。 为制备易于纯化的抗HIV1 外膜蛋白的单链抗体，本实验利用分泌型毕赤酵母系统对目的蛋白ScFv进行表达，构建了毕赤酵母重组表达质粒pPICgSCFV，经电击转化后，用PCR筛选得到了重组阳性酵母菌，该酵母菌经甲醇诱导后，可稳性表达ScFv目的蛋白，表达的ScFv目的蛋白以可溶性形式存在于酵母菌培养基上清中，具有良好的生物学活性，目的蛋白的表达量占培养基上清中总蛋白量的 18％左右。