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小RNA是指一类小片段的非编码RNA,主要通过RNA-RNA相互作用而对目标RNA进行调控,其中最重要和被广泛研究的作用即RNAi。RNAi是指由RNA分子介导的基因抑制,其包含了两大类RNA分子:microRNA和siRNA。microRNA是一类内源性的～22 nt的非编码小RNA,在生物体中广泛存在并具有高度的保守性,主要通过与mRNA的3’UTR结合,抑制基因翻译或者诱导mRNA的降解。siRNA是一类外源性或人工合成的～22 nt的非编码小RNA,其作用机制与microRNA相似,但可与目标mRNA的任意部位结合并介导mRNA的降解。RNAi在基因功能研究和疾病治疗方面都有广泛的应用,目前已有多种基于RNAi的药物进入临床试验。RNA适配体(RNA aptamer)是指能与给定的特定分子相结合的小片段的RNA,主要通过体外 SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)筛选而成。由于RNA适配体对其目标分子具有高度的特异性和亲和性,因而在生物化学的研究和疾病的治疗中有着广阔的应用前景,且已有RNA适配体(Pegaptanib)被美国食品药品监督管理局批准。目前用于RNAi和适配体研究的RNA试剂,主要采用化学或体外转录合成,成本较高。本课题通过生物技术的方法,成功构建OnRS(optimal noncoding RNA scaffold)骨架,并用于在大肠杆菌中高表达了具有生物学功能的microRNA,siRNA和RNA适配体,为RNA的研究提供了一种经济快捷高效的合成手段。1.OnRS骨架的构建通过tRNA支架在大肠杆菌中大量表达RNA已有报道,本章旨在构建含有不同的microRNA前体片段的质粒,通过转化大肠杆菌来表达不同的microRNA前体。首先利用人的基因组DNA为模板,根据不同的microRNA前体的序列设计不同的引物以扩增前体片段,采用无缝克隆(seamless cloning)的方法分别构建表达各个microRNA前体的质粒。将构建好的质粒测序验证后,转化大肠杆菌进行RNA的表达,提取细菌中的总RNA,通过变性聚丙烯酰胺/尿素凝胶电泳鉴定目标的microRNA前体在细菌总RNA中的表达量,结果显示,除了 tRNA/mir-34a,tRNA/mir-125b-1和tRNA/mir-1291之外,其余重组RNA在细菌总RNA中的表达量相当低,有的甚至没有表达。由于在所测定的11个microRNA前体的表达中,mir-34a的表达量最高,为了用这个系统大量表达其他的microRNA,我们采用不同microRNA的成熟序列替换microRNA 34a前体中miR-34a,再根据microRNA 34a前体中的碱基配对方式同时改变其3’序列,并将这个新的结构命名为OnRS。2.OnRS 高表达 microRNA(OnRS/miR-124)及功能研究本章利用OnRS的原理,将miR-124的序列替换microRNA34a前体中miR-34a的序列拟构建能在大肠杆菌中表达含有miR-124序列的重组RNA的质粒OnRS/miR-124,并同时插入一段随机序列构建一个实验所需的对照质粒OnRS/Neg。将构建好的质粒测序鉴定后,转化大肠杆菌,提取总RNA,电泳鉴定,结果显示目的RNA能在大肠杆菌中大量表达。用FPLC(fast protein liquid chromatography)纯化目的重组RNA后,将OnRS/miR-124转染A549细胞,两天后收集细胞,提取总RNA,进行小RNA的深度测序。测序结果表明,OnRS/miR-124能在细胞中被加工产生成熟的miR-124,细胞中其余小RNA的表达未发生明显变化,同时OnRS/miR-124中的tRNA也能在细胞中被加工成tRFs(tRNA fragments),且不同重组RNA之间tRFs的量无明显差异。确定OnRS/miR-124能在细胞中产生出大量成熟的miR-124序列后,进一步对其功能进行鉴定。结果表明,miR-124的靶蛋白STAT3和p-STAT3能被OnRS/miR-124所抑制,且OnRS/miR-124能够抑制细胞的增殖,同时诱导细胞凋亡,与文献报道相符合。上述结果表明,利用OnRS能够成功在大肠杆菌中表达具有生物学功能的microRNA。3.OnRS 高表达 siRNA(OnRS/GFP-siRNA)及功能研究确定OnRS能够成功表达microRNA后,鉴于microRNA和siRNA有着相似的作用机制,本课题进一步探索其是否能用于siRNA的表达。本章利用OnRS的原理,设计并构建了能表达一段22nt的GFP-siRNA的质粒OnRS/GFP-siRNA,质粒通过测序鉴定正确后,转化大肠杆菌,提取总RNA,经电泳鉴定,结果表明重组RNA在大肠杆菌中大量表达。通过FPLC纯化后,将OnRS/GFP-siRNA转染ES-2 GFP细胞,两天后提取总RNA进行小RNA的深度测度。测序结果表明OnRS/GFP-siRNA能在细胞中被加工产生成熟的GFP-siRNA,细胞中其余小RNA的表达未发生明显变化,OnRS/GFP-siRNA中的tRNA也能在细胞中被加工成tRFs,且不同重组RNA之间tRFs的量无明显差异。同时,OnRS/GFP-siRNA转染ES-2 GFP细胞,48 h及72 h之后都能发现和对照组相比细胞的荧光强度明显降低,转染72 h后测定GFP的mRNA表达同对照组相比明显降低。在确定OnRS/GFP-siRNA体外能有效抑制GFP的表达之后,进一步进行了体内实验的验证。对于高表达GFP的转基因小鼠静脉注射OnRS/GFP-siRNA和对照的OnRS/Heg,取小鼠肝脏,冷冻切片,观察OnRS/GFP-siRNA比对照组荧光强度明显降低,同时测定肝脏中GFPmRNA的表达与对照组相比也有显著降低。上述结果表明,利用OnRS能够成功在大肠杆菌中表达具有生物学功能的siRNA。4.OnRS高表达适配体(OnRS/MGA)及其在RNase活性测定中的应用研究本章进一步探索是否能利用OnRS表达功能性的RNA适配体。根据文献设计了能在OnRS的5’端或3’端表达孔雀石绿(malachitegreen,MG)适配体(MGA)的质粒OnRS/MGA5和OnRS/MGA3。转化细菌后提取总RNA鉴定,OnRS/MGA5和OnRS/MGA3都能在大肠杆菌中大量表达且能与MG结合皆能使MG的最大吸收从618 nm转移到630 nm,同时也能增强MG在630/655nm处的荧光。在确定OnRS能成功表达出功能性的MGA后,进一步考察了 OnRS/MGA5在测定核糖核酸酶活性方面的应用。首先确定荧光强度能随着MG和OnRS/MGA5浓度的增加而不断升高。同时,OnRS/MGA5能被人体中主要的核糖核酸酶RNaseA和血管生成素(Angiogenin)所降解。在确定OnRS/MGA5能被核糖核酸酶降解后,由于血清中富含多种核糖核酸酶,故进一步测定血清对OnRS/MGA5的降解。结果发现,OnRS/MGA5能被血清中的核糖核酸酶所降解,且荧光值与血清的量之间呈现经典的剂量-效应关系,同时加入核糖核酸酶抑制剂可使OnRS/MGA5与MG结合的荧光值保持不变。另外,基因传递试剂in vivo-jetPEI也能有效抑制血清中核糖核酸酶对OnRS/MGA5的降解。因此,拟采用OnRS/MGA5作为一个无标记的底物来测定不同病人血清样品中Rnase的活性。测定发现,胰腺癌病人血清中核糖核酸酶的活力(196±22)明显高于良性或正常人(118 ±8)。这为胰腺癌临床诊断也提供了一定依据。