决明(Cassia obtusifolia L.)是豆科一年生植物,作为传统药食同源的中草药,其干燥成熟种子即为决明子,是主要的药用部位。前期研究表明,决明中含有胰蛋白酶抑制剂,具有抗鳞翅目害虫的活性。本文首先通过对决明转录组数据的分析,从中筛选出一种Kunitz型胰蛋白酶抑制剂的候选基因,随后对该候选基因展开基因克隆、表达、生物信息学和表达模式分析,为后期该基因的功能鉴定与分子机制的研究提供依据。主要结果如下：1)采用RACE技术,首次克隆了决明Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因(CoTI2)全长,该序列全长为792bp,包含746bp的ORF,编码248个氨基酸,所表达的蛋白分子量为26.68 KDa,等电点为5.03,其中含有11.26%的酸性氨基酸,7.1%的碱性氨基酸,36.94%的中性疏水氨基酸和27.48%的中性亲水氨基酸,具有较强的疏水性。2)通过生物信息学初步对CoTI2蛋白的基本理化性质与结构进行预测：CoTI2的N端含有26个氨基酸的信号肽；主要定位于植物的膜外或液泡中,并且N端1-11个氨基酸残基在膜内,35-247个氨基酸残基在膜外,为跨膜蛋白；通过酶切位点分析,确定了CoTl2原核表达酶切位点分别为BamHI和EcoRI,真核表达酶切位点为BamHI和SnaBI;密码子偏好性分析表明决明CoTI2主要偏好使用以U/A结尾的密码子,这有利于CoTl2选择最优表达系统；CoTI2的二级结构中包含66个氨基酸的a螺旋,28个β折叠和154个无规则卷曲,无规则卷曲结构占总氨基酸的一半以上,推测决明CoTI2的功能结构域很可能就在这个位置；同源性分析出Lys108为关键残基,还含有Cys84, Cys135, Cys187, Cys200四个Cys,可能参与二硫键的形成；通过对CoTI2与其他物种KTI的进化关系分析得出,CoTI2与拟南芥进化关系更近,是最优真核表达系统。3) RT-qPCR结果表明决明CoTI2在不同组织中差异表达,在未成熟种子、果荚、愈伤组织和胚轴中优势表达,其中未成熟种子中表达量最高,花中相对表达量最低；在胁迫条件下,除盐胁迫基本不影响CoTI2的表达外,干旱、机械损伤、ABA、Meja和低温总体上均表现为表达上调,说明胁迫条件可以刺激CoTI2基因的表达,来抑制体内胰蛋白酶的降解。为研究决明CoTI2在不同组织中的功能以及在胁迫下的代谢通路提供依据。4)首次构建了CoTI2-pET28a原核表达重组质粒,转入大肠杆菌Rosetta (DE3)中诱导表达,并优化出最佳表达条件：1.6 mM的IPTG在27℃诱导表达7h,这为重组蛋白参与植物抗虫的分子机理的研究奠定基础。5)构建了ZCoTI2-pBI121真核表达重组质粒,并初步转化拟南芥,这为研究该基因在植物中的生理作用和后代遗传打下基础。