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砂梨(Pyrus pyrifolia Nakai)原产于我国中部、南部和西部各省，适于在温暖多雨地区栽培，是原产于我国的四个梨树种之一，具有耐热、抗旱、抗火疫病等优良性状。但其果实大多贮藏性差，如何提高果实耐贮性是解决砂梨产业化的关键问题。冷藏和气调贮藏是目前延长砂梨贮藏期的的主要技术手段，但这些技术在大多数砂梨品种上难以保证果实的长期贮藏，满足不了市场的需求.培育耐贮藏的优质新品种，结合保鲜剂等采后技术手段是解决砂梨贮藏问题的关键.我们以‘菊水’梨果实为材料，利用RT-PCR和RACE技术克隆到PpETR3和PpERS2两个乙烯受体基因cDNA全长，构建它们的RNAi表达载体，并将PpETR3表达载体通过农杆菌介导法进行番茄转化，获得了2个转基因株系，为进一步验证PpETR3乙烯受体在乙烯信号转导途径中的功能及培育耐贮藏的番茄新品种奠定基础。同时研究外源乙烯和乙烯受体抑制剂1-MCP(1-甲基环丙稀)熏蒸对采后不同时期‘菊水’(‘kikusui’)果实的生理以及PpETR3和PpERS2基因表达的影响.结合果实采后生理的变化，揭示PpETR3和PpERS2两个受体在乙烯信号转导过程中的功能。
1、为获得符合果实基因克隆和表达研究需要的RNA，我们以‘菊水’梨果实为材料，通过两种CTAB改良法提取不同后熟期的果皮和果肉的总RNA，研究果实不同后熟期对果皮和果肉总RNA提取的质量和产量的影响，并针对不同梨果实成熟阶段RNA提取的特点，对传统的CTAB法进行改良，以较低的成本从果实中提取完整性好、质量高的总RNA.同时在近成熟的‘红富士’葡萄、‘富士’苹果和‘丰香’草莓等3种果实上进一步验证，并通过RT-PCR验证，所提取的总RNA可以满足基因克隆和表达等分子生物学实验的要求。
2、根据已报道其它植物果实乙烯受体基因的保守区域设计简并引物，用RT-PCR和RACE的方法从‘菊水’梨果实中获得两个新的砂梨乙烯受体基因PpETR3和PpERS2的cDNA全长，分别为2707bp和2260bp，各有2223bp和1914bp完整的开放阅读框(ORF)，GenBank登录号分别为EU021507和EU117197。PpETR3编码741个氨基酸，其核苷酸和氨基酸序列与苹果、梨、李和桃等4中果实乙烯受体家族中ETR1亚类基因相似性和同源性在90-98％。分子结构预测：受体蛋白理论分子量为83.01kD，理论等电点为8.26.PpERS2编码638个氨基酸，其核苷酸和氨基酸序列与苹果、梨等果实乙烯受体家族ETR2亚类相似性和同源性为90-96％。分子结构预测：受体蛋白理论分子量为71.55kD，理论等电点为6.25。
3、用80μL-L-1外源乙烯和1.0μL-L-11-MCP熏蒸采后不同时期‘菊水’梨果实，在25±1℃贮藏温度下，研究处理后果实后熟过程中品质、生理指标的变化和乙烯受体基因PpETR3和PpERS2表达。结果显示：在采收当天和呼吸跃变初期，外源乙烯处理能促进果实硬度和可溶性固形物含量的显著地下降，降低活性氧清除酶(SOD、CAT和APX)的活性，提高呼吸速率和乙烯释放速率，促进果实后熟；1-MCP处理表现出与乙烯相反的效应，且采收当天比呼吸跃变初期的作用效果更明显。在呼吸跃变中期处理，外源乙烯和1-MCP作用效果均不明显。研究发现，外源乙烯和1-MCP对果实后熟的影响因处理果实后熟期的不同而存在显著差异，果实后熟程度越高，其处理的效果越不明显.在采收当天处理的果实后熟过程中，对照果实PpETR3和PpERS2表达总体上随着果实的后熟逐渐增强。1-MCP处理明显提高果实采后初期PpETR3基因的表达，降低果实采后中期PpERS2基因的表达，然而外源乙烯对果实采后初期PpERS2表达有明显的促进作用，对果实整个后熟期间PpETR3表达没有明显地影响。
4、以‘菊水’梨近成熟果实为材料，提取总RNA。通过RT-PCR技术克隆砂梨乙烯受体基因PpETR3和PpERS2反义、正义基因片段，然后将反义、间隔区YYT-1(GenBank登录号AY345165)和正义三基因片段串连，构建双链RNAi重组质粒，经鉴定测序正确后，作为外源基因单元插入酶切后的植物双元表达载体pYF7704质粒中，分别构建这2个乙烯受体基因双链RNAi表达载体pYF0810和pYF0811，并转化到农杆菌LBA4404感受态细胞中。
5、为了研究乙烯受体PpETR3干扰基因在植物体中的表达特性，通过农杆菌介导法转化番茄子叶，将侵染的493个外植体先经MS+ZT1mg/L+IAA0.5mg/L+Km50mg/L+250mg/L Cef+蔗糖30g/L+琼脂7g/L(pH5.8)筛选培养基，初步筛选出Km抗性芽。将筛选出的抗性芽再经2次继代培养，共得到26株抗性株系。将抗性株系转到生根培养基MS+IAA0.5mg/L+Km50mg/L+Cef250mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L(pH5.8)中生根，经过30d的生根培养，共得到了5个生根株系。经过PCR、RT-PCR检测验证，初步验证已得到2个番茄转基因株系。