油菜是我国重要的油料作物,菜籽油是人们生活用油的主要来源。随着国民经济的发展,生活水平的不断提高,对食用油品质的要求也在日益提高。因此,油菜品质育种逐渐成为现代油菜育种的重要组成部分。相同遗传背景下,黄籽油菜较黑籽油菜具有种皮薄、纤维素含量低、含油量高、饼粕蛋白质含量高等诸多优点。同时其榨取的菜籽油杂质少、清澈透明,易受消费者青睐,业已成为油菜品质育种中优良的种质资源。但大面积种植的甘蓝型油菜中并不存在天然的黄籽材料,使得这一优良性状在实际生产中的推广应用成为难题。目前很多科学家利用油菜的近缘种来创造甘蓝型油菜黄籽种质。白菜型油菜作为栽培油菜基本种,蕴含着丰富的黄籽资源,是创建甘蓝型油菜黄籽种质的重要物种之一。本研究通过白菜型黄籽油菜种皮色泽基因的克隆与功能分析,探讨了白菜型黄籽油菜形成的生物学基础。主要内容如下：1.初步定位显示,白菜型油菜种皮色泽基因位于A9连锁群SSR标记Lsr126与bsrl之间。在此基础上,利用http://brassicadb.org/brad/网站提供的白菜Scaffold序列信息,开发与目标基因共分离的SSR标记,最终锁定目标基因区段。该区段与拟南芥基因组同源线性比对分析显示,共包含at4g09820到at4g10620共计22个拟南芥同源基因。2.依据目标基因区段与拟南芥线性比对结果及白菜型油菜IP引物群体验证,选定BrTT8基因为候选基因。利用Tail技术和白菜基因组序列信息,设计特异引物TuLl/Rl,对白菜型油菜BrTT8基因进行全长扩增。3.等位基因序列分析显示,在近等基因系黄籽材料中BrTT8基因内存在大片段序列插入。插入序列分析表明,该序列具有新型转座子Helitron的结构特征：插入序列位于保守碱基AT之间,5’端起始于TC,3’末端结束于CTAG,在3’端上游6bp处有一段17bp长的回文序列。4. BrTT8基因在白菜型油菜近等基因系黑、黄籽材料中表达差异检测显示,黄籽材料开花后10天、20天、30天的种子中均未检测到BrTT8基因转录产物,而在黑籽材料中BrTT8基因正常转录。5.BrTT8基因全序列提交http://www.expasy.org/tools/protparam/网站进行蛋白结构预测,结果显示BrTT8蛋白包含520个氨基酸,分子量为59.5kD,其编码一个bHLH蛋白,蛋白羧基端附近有一个典型的bHLH结构域。6.利用农杆菌介导的转化方法,将BrTT8基因转入拟南芥tt8-1突变体,最终获得25个表型恢复的T1代拟南芥转化株。同时通过香草醛染色分析,转基因植株表型恢复源于原花色素在种皮的积累。由此说明,BrTT8基因有着与拟南芥TT8基因相似的功能,都参与了原花色素合成途径。7.白菜型油菜近等基因系黑、黄籽材料间,类黄酮途径结构基因Real-Time PCR分析显示,在黄籽材料中,晚期结构基因BrDFR、BrBAN表达量明显下降。但早期结构基因BrTT6和BrTT7的表达量在黑、黄籽材料间没有显著差异。以上说明在白菜型油菜中,BrTT8同样参与了类黄酮途径晚期结构基因的表达调控。8.对白菜型油菜近等基因系黑、黄籽材料,发育中的种子切片观察发现,在白菜型油菜黑籽材料中原花色素经过染色处理后,可以形成红色小颗粒沉积于内种皮细胞层中,而在黄籽材料种皮细胞中,则没有原花色素的沉积。而且,原花色素积累的细胞层在黄籽材料中已不复存在,取而代之的是细胞残片类似物,散落在内种皮细胞层间。但在拟南芥tt8-1突变体与野生型拟南芥的种皮结构显微观察发现,突变体tt8-1内种皮与野生型相比,只存在色素积累的差别,并没有细胞层结构的变化。推测白菜型油菜BrTT8基因与拟南芥TT8基因在功能上虽然相似,但并非完全相同。9.白菜型油菜黄籽沙逊是甘蓝型黄籽油菜No.2127-17重要亲本之一,但在以No.2127-17为亲本的近等基因系群体间BrTT8并未表现出多态性,说明甘蓝型油菜No.2127-17种皮色泽性状相关的N9连锁群上的主效QTL位点并非是BrTT8基因位点。综上所述,通过白菜型油菜种皮色泽相关基因BrTT8的克隆及功能分析,可初步将白菜型油菜黄籽沙逊与黑籽材料3H129所构建的近等基因系群体中,种皮色泽分离的分子机制概括如下：在该群体中,黄籽材料BrTT8基因由于转座子的大片段插入,引起了BrTT8基因序列的突变,从而导致这一重要转录因子功能的紊乱,使得类黄酮代谢途径中晚期结构基因不能正常转录,原花色素合成受阻,继而不能在黄籽材料内种皮中积累色素,最终种皮呈现无色透明,种子发育为黄籽。