论文部分内容阅读
丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge.)是唇形科鼠尾草属植物,其干燥根是中医临床常用的一味中药。研究表明丹参中水溶性酚酸类化合物具有抗肝纤维化、抗动脉粥样硬化、改善记忆功能障碍、抗艾滋等作用。在植物体内酚酸类次生代谢产物由苯丙烷类化合物生物合成途径合成。4-香豆酸：辅酶 A 连接酶(4-Coumarate:Coenzyme Aligase,4CL;EC6.2.1.12)在植物体内广泛存在,是苯丙烷类化合物生物合成途径中的关键酶。在很多植物中研究发现4CL基因表达受到外界环境和植物自身生长发育信号的调节。丹参中4CL基因的调控表达模式目前还不清楚。
基因的表达受到基因自身的启动子和一些转录因子的调控。我们实验室已从丹参中克隆得到4CL基因家族的2个成员,分别是Sm4CL1和Sm4CL2,并进行了体外功能研究。本文在此基础上应用染色体步行法克隆了Sm4CL1和Sm4CL2基因的启动子,并对其功能和表达调控的模式进行研究,研究结果如下：
1、得到Sm4CL1基因启动子2个拷贝分别是pSm4CL1-A(EF458149)和pSm4CL1-B。pSm4CL1-A为转录起始位点上游2.068kb,pSm4CL1-B为转录起始位点上游1.645kb。得到Sm4CL2启动子转录起始位点上游750bp,GenBank登录号为EF458150。序列分析发现Sm4CL1-A和Sm4CL2启动子内部存在一些在.PAL、4CL、C4H等苯丙烷类化合物生物合成相关基因中保守的顺式作用元件,如A-box、L-box、E-box、AC-I、AC-II、W-box。
2、将获得的启动子与GUS报告基因连接构建植物表达载体并转化拟南芥,GUS组织化学染色分析表明,pSm4CL1驱动GUS在拟南芥子叶的顶端和下胚轴表达,在生长40d拟南芥叶片的边缘表达,花的萼片、花药中表达。pSm4CL2驱动GUS主要在拟南芥子叶的叶脉和根中表达,花的萼片、花丝和柱头及果荚上表达。说明Sm4CL启动子具有组织特异性表达的特性,且启动子驱动GUS表达受生长发育信号的调控。
3、构建了部分5-缺失启动子融合GUS基因的表达载体,分析发现,pSm4CL1-A的-556/+29bp、pSm4CL2的-379/+95bp均能够驱动GUS正常表达,说明pSm4CL1-A的-556/+29bp序列和pSm4CL2-379/+95bp序列具有基本的启动子功能。
4、转基因拟南芥纯合体株系的创伤、光照和茉莉酸甲酯诱导实验发现,pSm4CL2-750/+95bp、-379/+95bp启动子片断驱动GUS表达受创伤诱导明显,pSm4CL1-A的-556/+29bp启动子片断驱动GUS表达受到创伤、光照和茉莉酸甲酯的诱导,pSm4CL1-B-1645/+29bp启动子片断驱动GUS表达受光照诱导。
5、组织特异性半定量RT-PCR分析表明,SmCL1基因在丹参植株中的表达量为：叶>茎=根,而Sm4CL2为根>>叶>茎。
6、茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate,MeJA)和酵母激发子(Yeast Elicitor,YE)分别处理未转基因的丹参毛状根,半定量RT-PCR实验发现,MeJA和YE对Sm4CL1和Sin4CL2基因均有诱导作用,其诱导情况有所不同。