核糖核酸（RNA）在生命体系中扮演着多种重要的角色,从担当遗传信息传递的中心媒介（信使RNA）或直接作为一些病毒遗传信息的载体到调控基因的转录和翻译（微小RNA）、细胞结构（核糖体RNA）的组建,再到运输（转移RNA）和催化（核酶）,RNA可以说是功能最为多样化的一类生物大分子。这些功能的行使与其在细胞中的时-空表达和分布密切相关,因此对RNA进行检测分析和长时间可视化示踪具有十分重要的意义。荧光探针因其不仅可以实现定量检测,还可以实时监测细胞内RNA的动态变化过程,因此成为RNA研究中的重要手段。目前常用的RNA荧光探针主要包括有机荧光小分子、金属纳米簇和半导体量子点等,但是这些探针或存在合成步骤繁琐费时,或存在光稳定性差以及生物毒性较高等缺陷,不能满足长时间实时成像的需求。作为一种“明星”碳纳米材料,荧光碳点（简称碳点）具有制备简单、尺寸小、水溶性好、发光波长可调等优势,被认为是有机荧光小分子和量子点的无毒替代荧光探针,因此在生物分子的分析检测和实时成像等领域中的应用前景较为广阔。目前碳点主要通过两种途径实现上述应用:其一是作为荧光共振能量转移（FRET）的能量供体与其他的荧光基团或猝灭剂构建FRET体系;其二是在表面修饰上相应的靶向分子,而这两种途径均需要对碳点进行表面修饰。现有的表面修饰方式包括非共价和共价修饰两种。其中非共价修饰主要有静电结合、π-π堆积、氢键作用和配位作用,这种结合方式虽然操作简单,然而存在选择性较差等缺陷,而共价修饰不仅增加了操作步骤,而且还存在着修饰效率低、可能改变碳点的荧光性质等弊端,这极大地限制了碳点的实际应用。针对上述存在的问题和难点,本论文利用免修饰策略构建了基于碳点的RNA检测和成像探针。首先借助脂质体的包封能力开发了碳点免修饰参与构建FRET体系的新模式,即将碳点和BHQ-2猝灭剂同时包封在脂质体中组装成FRET软纳米球,并将其应用于细胞外miRNA的高灵敏、高选择性检测。此外还建立了靶向碳点的免修饰原位合成方法,并以RNA为研究对象,仅通过原料筛选就成功合成具有长时间靶向成像活细胞内RNA能力的碳点。具体的工作如下:1.荧光共振能量转移软纳米球的制备及其在miRNA检测中的应用即便作为一种良好的能量供体,因其表面修饰困难使得碳点在FRET中并未得到充分的应用。借助脂质体的包封功能,我们将作为能量供体的碳点和受体BHQ-2以高浓度的形式包封于同一个空间内,拉近供受体间的距离,成功地制备了FRET软纳米球（fSNBs）。再引入双链特异性核酸酶（DSN）辅助的靶物循环放大策略和能够破裂脂质体的磷脂酶A₂（PLA₂）,建立了双重信号放大方法,并将其应用于微小RNA-141（miR-141）的高灵敏、高选择性检测。碳点的荧光强度随着miR-141浓度的增加而呈线性增强,线性范围为0.025-10 nM,检测限为16.5pM。与无FRET的软纳米球（CDs-SNBs）参与的检测体系相比,该方法的检测限降低了约515倍。此外,该方法还具有通用性、高选择性和较好的准确性,能够识别单个碱基差异的miRNA序列,并且可以应用于细胞实际样中miRNA的检测。2.RNA靶向碳点的免修饰原位合成根据现有靶向探针的结构特征有目的地筛选原料分子,建立了相应靶向碳点的原位合成方法,并以合成RNA靶向碳点为例来验证该方法的可行性。首先通过比较所有RNA特异性有机荧光小分子的结构,总结其共同结构特征,即均具有苯环、含氮杂环和胺类。根据该共同特征,我们选择了具有苯环、胺类且易于形成含氮杂环的前体分子——苯二胺和三亚乙基四胺（TETA）为反应原料,通过简单的水热法合成了三种具有荧光性质的碳点。其中只有间苯二胺和TETA合成的碳点（m-CDs）具有RNA靶向性,且还具有较强的光稳定性和低生物毒性。通过红外光谱、X射线光电子能谱、核磁共振谱以及高分辨质谱等多种表征手段表明m-CDs表面存在异喹啉和胺类结构,而这些结构也同样存在于一些RNA特异性染料分子中。根据核磁共振谱和Zeta电位结果,我们推测m-CDs主要通过其表面的异喹啉结构与RNA碱基间的π-π堆积以及静电作用实现RNA特异性。此外,在非RNA靶向碳点的表面修饰上含有异喹啉和胺的有机小分子后,该碳点出现了RNA靶向效应,这一现象说明异喹啉和胺结构对RNA靶向具有重要的意义,并提出了异喹啉结构的形成机制。3.碳点在长时间实时监测活细胞内RNA动态变化中的应用及其生物效应现有的RNA成像探针因其光稳定性差、生物毒性高等缺陷,不能应用于长时间成像活细胞内的RNA,因而无法提供一些重要细胞过程中的RNA动态分布信息,而这些信息在研究RNA的功能、揭示其动态变化与一些重要细胞过程之间的密切联系中具有重要的意义。实验证明m-CDs不但满足长时间成像细胞内RNA所必需条件,如良好的光稳定性、生物相容性和RNA特异性,还具有通用性,不仅适用于人细胞系中的RNA成像,在植物组织和动物组织中同样适用。利用该碳点实现了长时间实时监测（时间长达3天）三种不同细胞生理过程（包括细胞分裂、药物诱导的细胞死亡以及细胞增殖过程）中RNA的动态变化。考虑到m-CDs在细胞和活体内的生物效应研究可以为药物研发、作用靶点的寻找及其可能存在的生物危害提供依据,我们同时也探究了m-CDs的细胞内化途径和在斑马鱼体内的毒性、分布以及代谢途径。该碳点主要通过小窝蛋白介导的内吞途径进入细胞,再通过微管介导的运输途径到达核周区域,最后通过核孔进入细胞核,到达核仁。此外,在一定浓度范围内m-CDs对斑马鱼胚胎的发育、孵育率以及生存率均没有明显的影响。m-CDs进入斑马鱼稚鱼体内后主要分布于皮肤色素细胞、眼球、前肾、肠、肝脏以及血液中,并于48小时后从体内完全排出,说明该碳点具有较好的生物安全性。根据其分布,我们推测斑马鱼对m-CDs的代谢途径主要有两种,其一为口→肠→泄殖腔;其二为皮肤/肠→血液循环→前肾/肝→泄殖腔。综上所述,本研究以RNA的检测和成像为核心,提出了利用免修饰策略构建基于碳点的RNA检测和成像探针,并将其应用于细胞外miRNA的高灵敏、高选择性检测和细胞内的RNA长时间成像,又对其在细胞水平和个体水平的生物效应进行了探索。本研究为RNA研究提供了安全、有力的工具,同时也为碳点在靶向成像和生化分析检测中的应用提供了新思路。