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研究背景:骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs）具有多向分化潜能,促进BMMSCs成骨向分化是骨再生和骨代谢性疾病治疗的关键。多种信号通路参与调控BMMSCs成骨向分化,而蛋白磷酸化在信号通路活化中发挥重要作用。蛋白磷酸化是由激酶和磷酸酶催化的可逆的动态过程。双特异性磷酸酶（dual specificity phosphatases,DUSPs）是一类特殊的磷酸酶,既可以去酪氨酸残基磷酸化又可以去丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化,在多种生理、病理过程,包括骨稳态中发挥重要作用。DUSP5是DUSPs超家族中的一员,研究表明DUSP5可通过抑制破骨缓解关节炎症,而DUSP5在BMMSCs成骨向分化中的作用和调控机制目前尚不明确。研究目的:本研究旨在探索双特异性磷酸酶DUSP5在BMMSCs成骨分化过程中的作用及其具体分子机制,并初步探索DUSP5在骨质疏松中的潜在治疗效果。材料与方法:（1）诱导人骨髓间充质干细胞（human BMMSCs,hBMMSCs）成骨分化7天、14天,碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）和茜素红（alizarin red S,ARS）染色及定量分析证明诱导成功,通过qRT-PCR和western blot检测DUSP5在成骨过程中的表达变化。（2）构建DUSP5稳定敲低、过表达和rescue细胞系,成骨诱导后进行ALP和ARS染色及定量分析、qRT-PCR和western blot检测成骨分化相关因子OSX和RUNX2的表达变化;将对照组、敲低组/过表达组/rescue组hB3MMSCs接于β磷酸三钙（β-tricalcium phosphate,β-TCP）支架材料,植入裸鼠背部皮下,8周后取材,H&E染色及osteocalcin（OCN）免疫组织化学染色检测体内异位成骨效果。（3）Western blot检测对照组、敲低组/过表达组/rescue组hBMMSCs中SMAD2/3和SMAD1信号通路关键蛋白,p-SMAD2和p-SMAD3;p-SMAD1/5/9、p-SMAD1/5和p-SMAD1 的表达水平,明确DUSP5对SMAD通路活化状态的影响。在过表达DUSP5中敲低SMAD1后,进行成骨诱导,ALP,和ARS染色及定量、qRT-PCR和western blot检测hBMMSCs成骨功能变化。（4）通过蛋白免疫共沉淀（protein immunoprecipitation,Co-IP）的方法初步检测DUSP5和SMAD1磷酸酶PPM1A、PP1、PDP和SCP1/2之间是否存在相互作用。明确与DUSP5相互作用的SMAD1磷酸酶后,设计带GST标签的DUSP5质粒,在BL21大肠杆菌中表达GST-DUSP5蛋白并进行提取纯化,通过GST pull-down实验进一步验证DUSP5与SMAD1磷酸酶之间的直接相互作用。在DUSP5敲低hBMMSCs中敲低或在DUSP5过表达hBMMSCs中过表达与之相互作用的磷酸酶,western blot检测SMAD1的磷酸化水平,以明确DUSP5对SMAD1通路的调节作用是否依赖SMAD1磷酸酶。（5）根据蛋白的功能域设计DUSP5和SMAD1磷酸酶的分段质粒,Co-IP检测DUSP5和SMAD1磷酸酶相互作用的具体结构域。（6）在HEK293T细胞中过表达或敲低DUSP5,Co-IP检测SMAD1磷酸酶和SMAD1之间的相互作用变化。（7）构建小鼠卵巢去势（OVX）诱导的骨质疏松组和假手术（SHAM）对照组动物模型。3个月后取小鼠的股骨进行micro-CT扫描、形态学分析、H&E切片及OCN免疫组织化学染色,验证模型构建成功;取小鼠股骨骨髓间充质细胞（mouse bone marrow mesenchymal stromal cells,mBMMSCs）进行体外培养,通过qRT-PCR和western blot检测Dusp5的表达水平。剩余OVX小鼠尾静脉注射对照（vector）或Dusp5过表达组（Dusp5）慢病毒,1个月后取股骨进行micro-CT扫描、形态学分析、H&E切片染色和OCN免疫组织化学染色,观察骨质疏松情况;取SHAM组、OVX组、OVX+vector组和OVX+Dusp5组mBMMSCs进行体外成骨诱导,ALP和ARS染色和定量分析、qRT-PCR和western blot检测细胞成骨分化能力。结果:（1）hBMMSCs成骨过程中,DUSP5表达明显上调。（2）DUSP5促进hBMMSCs体内外成骨分化。敲低DUSP5,hBMMSCs成骨向分化能力减弱,体内异位成骨减少;过表达DUSP5促进hBMMSCs成骨向分化并增强其异位骨形成能力;DUSP5 rescue的hBMMSCs体内外成骨向分化能力有所增加。（3）DUSP5通过活化SMAD1信号通路促进hBMMSCs成骨分化。DUSP5不影响SMAD2/3通路的磷酸化。敲低DUSP5后SMAD1 通路关键指标,p-SMAD1/5/9、p-SMAD1/5和p-SMAD1表达明显降低;而过表达DUSP5后上述指标明显增加;DUSP5 rescue组较敲低组上述指标表达量有显著回升。DUSP5过表达细胞中敲低SMAD1后,hBMMSCs的体外成骨分化能力下降。（4）DUSP5以依赖SCP1/2的方式活化SMAD1信号通路。DUSP5与SMAD1磷酸酶PPM1A、PP1和PDP之间无相互作用,而与SCP1/2之间存在相互作用。DUSP5敲低基础上再敲低SCP1/2和DUSP5过表达基础上再过表达SCP1/2,都会使SMAD1通路关键蛋白磷酸化水平有所恢复。（5）DUSP5的连接部位和SCP1/2的磷酸酶结构域相互作用。仅含有连接区域的DUSP5分段蛋白可以与SCP1/2相互结合,仅含有磷酸酶结构域的SCP1/2分段蛋白可以和DUSP5相互结合。（6）DUSP5抑制SCP1/2与SMAD1之间的相互作用。敲低DUSP5后,SCP1/2与SMAD1之间的相互作用增强,而过表达DUSP5则抑制SCP1/2与SMAD1之间的相互作用。（7）过表达Dusp5抑制骨质疏松小鼠骨量丢失。DUSP5在OVX组的表达量较SHAM明显降低。OVX+Dusp5组较OVX组骨质疏松症状明显改善,相应mBMMSCs的体外成骨能力显著增强。结论:本研究发现DUSP5促进BMMSCs成骨分化。DUSP5通过连接部位与SCP1/2的磷酸酶结构域之间相互作用,抑制SCP1/2对SMAD1的去磷酸化作用,从而活化SMAD1通路,促进BMMSCs成骨分化。Dusp5过表达能够显著抑制骨质疏松小鼠的骨量丢失。上述研究为针对DUSP5的连接部位设计特异性小分子化合物,促进以BMMSCs为基础的骨再生以及骨代谢性疾病的治疗提供了全新思路。