【摘 要】
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背景:Slingshot（SSH）是cofilin磷酸酶保守家族的成员,可特异性去磷酸化并激活cofilin,从而使肌动蛋白细胞骨架重塑,在细胞迁移、肿瘤侵袭、有丝分裂、神经元发育和突触可塑性等方面产生重要作用。SSH2作为双特异性磷酸酶家族（DSP）成员,具有一般磷酸酶活性,目前SSH2磷酸酶在2007年解析出催化结构域（P结构域）,对于N端结构域自抑制机制研究、结构解析以及关键氨基酸残基尚不明
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背景:Slingshot（SSH）是cofilin磷酸酶保守家族的成员,可特异性去磷酸化并激活cofilin,从而使肌动蛋白细胞骨架重塑,在细胞迁移、肿瘤侵袭、有丝分裂、神经元发育和突触可塑性等方面产生重要作用。SSH2作为双特异性磷酸酶家族（DSP）成员,具有一般磷酸酶活性,目前SSH2磷酸酶在2007年解析出催化结构域（P结构域）,对于N端结构域自抑制机制研究、结构解析以及关键氨基酸残基尚不明确。目的:本研究根据蛋白结构预测软件及保守性分析克隆构建了多个SSH2 N端截短体,旨在探究SSH2 N端自抑制的分子机理、结构信息以及从结构生物学角度探究SSH2磷酸化调节机制。方法:1.采用分子克隆技术构建表达载体,利用大肠杆菌原核表达系统,通过亲和层析、离子交换层析及凝胶色谱层析技术大量表达纯化SSH2 N端截短体蛋白。2.对成功表达出的目的蛋白进行SDS-PAGE定量分析,利用全波长酶标仪测量酶反应产物在特定波长下的吸收峰,分析SSH2蛋白截短体及C392S突变体对两种人工底物及P-cofilin小肽底物的酶学性质差异。根据常见模式物种的序列比对分析,将保守氨基酸突变后进一步分析酶活性。3.利用带生物素标签的P-cofilin短肽与SSH2截短体蛋白进行pull down实验以及免疫印迹实验分析不同结构域之间结合能力的差异性。4.根据以上酶活性结果及Alpha Fold结构预测,构建表达纯化68-454 aa C392S突变体及68-245 aa截短体蛋白,通过晶体初筛、晶体优化、seeding实验以及96孔板添加剂筛选技术获得晶体,利用X射线衍射技术解析蛋白结构。结果:1.克隆构建并纯化表达出SSH2多个N端截短体及其突变体,包括9个野生型,10个突变型。2.通过酶活性比较分析,发现对于pNPP、DIFMUP和P-cofilin底物,SSH2 31-490aa酶活性高于1-490 aa,SSH2截短体C392S突变后对于底物酶活性几乎完全丧失,与P-cofilin小肽的结合能力增强。3.将自抑制区域三位保守氨基酸进行R8E、S17A、C19S突变后,发现R8E能够提高p NPP的酶活性,三者的突变均能提高DIFMUP酶活性,C19S突变能提高P-cofilin底物的活性。4.表达纯化出纯度较高的68-454 aa C392S突变体及68-245 aa截短体,获得了衍射分辨率达到1.79（?）的68-245 aa的结构,晶体空间群为P212121,晶胞参数a=65.08,b=68.1,c=81.114,α=β=γ=90°,一个不对称单位里由两个相同分子组成。结论:鉴定出SSH2蛋白活性自抑制区域1-30 aa以及对N端自抑制起关键作用的氨基酸残基,以高分辨率解析出SSH2 N端区域内的68-245 aa蛋白晶体结构,为SSH2磷酸化调节机制研究以及结构抑制剂和激活剂的筛选提供理论依据。
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＜正＞慢性心功能不全多采取强心、利尿等常规治疗，虽然可以在一定程度上改善患者的临床症状，但是整体效果并不理想。有研究显示，美托洛尔联合曲美他嗪治疗慢性心功能不全预后效果较好，可起到增效作用，提高了患者的生活与生存质量。基于此，本文探讨美托洛尔联合曲美他嗪治疗慢性心功能不全的疗效，现报告如下。1资料与方法1.1临床资料选取2019年5月—2020年4月于我院治疗的80例慢性心功能不全患者作为研究对象
背景:胶质瘤是人颅内最常见的恶性肿瘤,近年来,虽然对胶质瘤的分子生物学特征方面有了较大进展,但在治疗方面仍未取得很大突破。寻找新的重要分子标志物对胶质瘤分子病理分型诊断、治疗及预后判断有深远的意义。本实验室前期研究发现:T细胞来源的蛋白激酶（TOPK）在胶质瘤中高表达,与胶质瘤分级呈正相关,患者的预后呈负相关;TOPK不仅促进胶质瘤细胞的生长,还直接磷酸化ULK1抑制自噬起始进而促进对替莫唑胺（T
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