研究背景和目的：乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。肿瘤转移是恶性肿瘤的基本生物学特征,是肿瘤复发、治疗失败和死亡的主要原因,因此寻找与乳腺癌转移相关的分子靶点,纠正和改善其恶性生物学行为,起着越来越重要的作用。文献报道,p32在甲状腺癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌、食管癌以及肺腺癌组织中高表达,另外,在乳腺癌中,p32mRNA含量增高,p32mRNA的表达量与乳腺癌淋巴结转移有关,但其具体机制尚不明确。本研究第一部分运用免疫组化的方法探讨了p32在乳腺癌组织中的表达,以及与临床病理参数之间的关系,尤其是p32与肿瘤转移的关系。本研究第二部分中,进一步利用小RNA干扰技术降低p32在乳腺癌细胞中的表达水平,在细胞水平探讨p32降表达对EGF诱导的肿瘤细胞趋化运动和转移的影响,并研究p32在肿瘤细胞运动和转移中的相关分子机制,以阐明p32蛋白与乳腺癌细胞运动和转移之间的关系,最后运用细胞转染技术建立p32降表达乳腺癌细胞系和小鼠实验转移模型探讨p32对乳腺癌细胞在体内转移的影响。深化对肿瘤细胞转移分子机制的认识,为临床肿瘤抗转移治疗提供新的思路和靶点。研究方法：1)免疫组化方法检测p32在人乳腺癌组织和乳腺小叶增生组织中的表达,分析p32的表达与肿瘤转移等临床病理参数的相关性。2)应用Western blot的方法检测不同乳腺癌细胞系中的p32表达水平,并用免疫荧光染色的方法和细胞成分分离的方法检测p32在细胞内的定位。3)MTT实验和软琼脂克隆形成实验,探讨运用小RNA干扰技术降表达后p32对MDA-MB-231细胞的增殖的影响。4)趋化运动实验和划痕实验,探讨运用小RNA干扰技术降表达p32后对乳腺癌细胞运动能力的影响。5)P32在细胞的氧化磷酸化中起重要作用,采用线粒体有氧呼吸链复合物Ⅰ抑制剂Rotenone检测其在细胞运动中的作用,探讨氧化磷酸化在细胞运动中的作用。6)构建p32过表达质粒,并转染入HEK293细胞中,做质谱分析,寻找与p32相互作用蛋白,从而深入探讨p32影响细胞运动的分子机理。质谱分析结果发现,PKCζ是p32的相互作用蛋白之一,再用免疫共沉淀的方法验证二者之间是否存在相互作用。7)采用PKCζ的磷酸化特异性抗体检测p32降表达对EGF刺激后PKCζ的磷酸化水平的影响,同时用免疫荧光的方法检测p32对PKCζ膜转位的影响及降表达PKCζ观察PKCζ对p32定位的影响。8)分别构建p32和PKCζ不同片段的载体,明确p32与PKCζ的结合部位,进一步探讨p32与VKCζ之间的调控关系。并用不同片段的p32载体对降表达细胞进行拯救,探讨p32在运动中起作用的结构域。9)划痕实验,运用免疫荧光染色的方法检测高尔基体和γ-tubulin再定位的情况,GSK-3β的磷酸化情况,从而探讨p32对细胞极性的影响。肌动蛋白聚合实验,探讨EGF刺激不同时间后肌动蛋白聚合的变化,采用磷酸化特异性抗体检测p32表达对EGF刺激后cofilin磷酸化水平的影响。10)建立稳定转染空载体,稳定转染p32降表达的乳腺癌MDA-MB-231细胞系,将对照组和降表达组分别通过尾静脉注射入SCID小鼠体内,构建实验转移小鼠模型,探讨p32降表达在小鼠体内转移的影响。结果：1) P32在乳腺癌组织中的表达较乳腺小叶增生组织中的表达明显增高,而且这种高表达与肿瘤的TNM分期、远处转移相关。2) P32在乳腺癌细胞中高表达,并在高转移的细胞系MDA-MB-231、BT549、ZR-75-30细胞中的表达明显要高于低转移细胞系T47D。p32主要分布在线粒体中,也分布在细胞膜、细胞质、细胞核中,在EGF的刺激下,p32从细胞质转位到细胞膜上。3)应用小RNA干扰技术转染乳腺癌细胞后,p32的蛋白水平均明显下降。4)P32降表达的乳腺癌细胞的增殖能力比对照组明显减弱(P<0.05)。5)P32降表达的乳腺癌细胞的趋化运动能力和迁移能力比对照组明显减弱(P<0.001)。6)运用线粒体有氧呼吸链复合物Ⅰ抑制剂Rotenone,发现Rotenone对细胞的运动没有明显影响。7)质谱分析发现,PKCζ、BAT2、CHCHD2、Lamin-B receptor等蛋白可以与p32相互作用。免疫共沉淀和免疫荧光的方法证实p32与PKCζ二者之间确实存在相互作用。而且在EGF的刺激作用下,二者可以共定位于细胞膜。8)当p32表达降低后,EGF诱导的PKCζ磷酸化和pkgζ的膜转位都减少。但是PKCζ降表达对p32的膜转位没有影响。9)P32的74-144aa片段与pkcζ的调节结构域结合,用p32的不同片段转染入降表达p32的细胞中,74-174aa片段可以拯救p32降表达细胞中EGF诱导的PKCζ膜转位,并部分恢复细胞的迁移能力。10)P32降表达后,划痕运动中leading edge细胞的高尔基体和γ-tubulin的再定向减少,GSK-3p的磷酸化水平减弱,细胞的极性减弱。P32降表达的细胞F-actin聚合比对照组细胞减少(P<0.05)。Western blot证实,降低p32的表达能够明显减低与F-actin聚合和解聚相关的cofilin的磷酸化水平。11)P32降表达细胞组在肺内形成的转移性癌结节明显少于对照组。结论：1)P32在人乳腺癌组织标本中高表达,并与肿瘤病人的TNM分期和癌细胞的远处转移相关。2)P32在乳腺癌细胞中高表达,主要分布在线粒体,也分布在细胞膜、细胞质和细胞核。3)P32参与了EGF诱导的乳腺癌细胞的趋化运动和迁移。P32降表达使乳腺癌细胞趋化运动能力、迁移能力和细胞极性、肌动蛋白聚合能力都明显减弱。4)P32在乳腺癌细胞的运动中起重要作用,这种作用不依赖于细胞的有氧磷酸化。5)P32与PKCζ的调节结构域结合,并通过调节PKCζ的活性而影响GSK-3β和cofilin的活化来调节细胞极性和骨架重排。6)在体内实验中,p32降表达可以降低乳腺癌细胞的转移能力。