论文部分内容阅读
禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)是引起小麦赤霉病的主要病原菌。该病菌能够产生真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)。研究已发现,通过外源cAMP处理或者敲除编码磷酸二酯酶的基因PED2会使其毒素水平上调。为了进一步了解禾谷镰刀菌中cAMP-PKA信号通路的作用,我们在本研究中对PKA调节亚基基因PKR的功能进行了解析。PKR是cAMP在真菌细胞中已知的唯一作用靶标,PKR基因的敲除导致了禾谷镰刀菌在生长,产孢和植物侵染方面存在严重缺陷,pkr突变体生长速率减缓,气生菌丝变短,菌丝细胞中核数量增多;分生孢子没有明显的足细胞,分生孢子较短且不呈典型的镰刀状,呈现出严重的空泡化现象。突变体分生孢子碘化丙啶染色后表现出较强的荧光信号,表明其细胞壁破损。自噬小体数量增多,表明细胞凋亡进程提前。pkr突变体不产子囊壳,表明其有性生殖进程受阻;突变体对小麦穗和玉米须的致病性下降,而DON毒素产量增加,表明PKR对DON产生起负调控作用。研究发现,pkr突变体不稳定,在培养过程中能够产生自发突变的现象。通过分离纯化得到67个突变菌株(角变子),发现它们的生长速率都得到了不同程度的回复。其中三个角变子(H1,H2,H3)的生长速率与菌落形态已基本恢复至野生型水平,但产孢量分别为野生型水平的0.7%,29.5%,5.0%。通过对选取的三个代表性角变子菌株(H3,H7,H14)的18个PKA相关候选基因的测序分析发现,PKA催化亚基CPK1中出现了非同义替换单点突变,分别为E406A(H3)和H531R(H7)。进一步对余下的64个角变子菌株进行测序,通过序列比对发现还有10个角变子也存在CPK1基因九个不同位点的突变,通过qRT-PCR对12个角变子进行PKA催化亚基CPK1、CPK2表达量的测定,发现12个角变子中的CPK1、CPK2表达量回复至野生型的水平,说明CPK1的基因突变能够抑制PKR敲除带来的PKA催化亚基表达水平的变化。通过对四个角变子(H22,H30,H35,H57)的全基因组测序,发现了四个不同基因(CYC8,MIG1,NHP6A/B,SGF73)的突变。综上所述,PKR基因对禾谷镰刀菌的菌丝生长、发育、致病性和毒素产生起着重要的调控作用,且CPK1的突变能够修复PKR缺失导致的缺陷,pkr突变体角变子突变基因的鉴定有助于进一步阐明cAMP信号网络调控机制。