近20年来，以植物表达系统在重组蛋白的大规模化生产上显示出了强大的竞争优势。与传统的生物反应器相比，植物生物反应器具有投资少、表达产物安全可靠、具有翻译后修饰等优点。但是植物生物反应器也有自身的限制因素包括外源蛋白表达量低，下游纯化加工困难，重组糖蛋白上糖基结构与哺乳动物中有一定的差别等。 绝大多数药用蛋白在其天然状态下是糖蛋白，并且蛋白的糖基化对其生物活性、蛋白的正确折叠、蛋白的稳定性等特征有重要影响。虽然在植物细胞内蛋白的糖基化修饰过程与哺乳动物中的相似，但是仍与其N糖链的天然形式存在着一定的差别。植物表达的蛋白上特征的N糖基在临床应用中将有可能产生免疫应答反应。我们的论文主要从这个方面入手，以三种不同的策略研究如何优化植物生物反应器的N糖基化系统。 第一，植物生长的不同阶段蛋白上的糖基化程度不同。本研究首先对烟草BY2细胞(Nicotiana tobacum L.cv．Bright Yellow2)在不同生长时期N聚糖的种类分布及其对小鼠的免疫原性进行了详细分析。随着细胞的生长，植物特有的β1，2-木糖和α1，3-岩藻糖也随之增加，同时相应的蛋白提取物在小鼠中引起的免疫应答反应也逐渐增强。在BY2细胞中表达大鼠的促红细胞生成素后测定发现起始期和对数期的细胞中，重组的促红细胞生成素上只含有少量的植物特有的N糖基。因此，这个研究结果为在植物中生产低植物特征N糖基化和低免疫原性的重组药用蛋白提供了简单有效的方法。 第二，近年来RNAi沉默的方法被证明能有效去除糖基转移酶的作用，从而达到降低糖蛋白上相应糖基的目的。本研究通过与其它物种中同源蛋白的比较设计了兼并引物，从烟草BY2细胞中扩增出未曾报道的烟草β-1，2-木糖转移酶的基因片段和α-1，3-岩藻糖转移酶的基因片段。通过同源比对，发现这两个片断所翻译得蛋白与其它植物物种中的糖基转移酶基因的相应区域具有很高的同源性。利用这两个片断的反向重复序列构建了能同时沉默这两个基因的载体。将这个载体转化BY2细胞，经检测，烟草β-1，2-木糖转移酶基因和α-1，3-岩藻糖转移酶基因的RNAi片段在稳定转化的烟草BY2细胞中转录后能使β-1，2-木糖糖基和α-1，3-岩藻糖糖基的含量有较为明显的下降。这证明本研究中使用这两个片断的RNAi作用确实有效。 第三，植物中缺少哺乳动物所特有的β-1，4-半乳糖转移酶基因，所以不能在N糖链的末端加上β-1，4-半乳糖糖基。本研究中应用CLX诱导系统在烟草BY2细胞中诱导表达了人类的β-1，4-半乳糖转移酶基因。通过Northern blot试验证明在烟草BY2细胞中，CLX系统诱导表达的β-1，4-半乳糖转移酶基因是严格受雌二醇诱导的，在无诱导剂的情况下没有基因表达的渗漏。进一步的Western blot试验证明转入的诱导表达的β-1，4-半乳糖转移酶能给细胞中的内源蛋白上加上β-1，4-半乳糖糖基。