目的：　　 脓毒性休克(septic shock)，因可造成多器官功能障碍或衰竭而具有极高的病死率，一直备受医学界关注。早期液体复苏是逆转脓毒性休克有效循环血量不足、防治多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndyome，MODS)的重要和必要手段。急性肺损伤（acute lung injury, ALI）是脓毒性休克最常见的并发症，虽然有临床试验报道早期液体复苏能改善脓毒性休克合并ALI患者的预后，但也有研究称大量补液可使液体在组织间隙储留而加重休克患者的肺损伤，那么对脓毒性休克合并ALI的患者，如何进行液体管理成为许多临床医生的困扰。治疗脓毒性休克传统的补液方法为在扩充血容量基础上，若不能维持有效灌注压再应用血管活性药物，而最近有研究报道在补液同时应用升压药-去甲肾上腺素，能明显降低达到目标血压的补液量，在保证中心灌注压的同时对末梢循环也有改善作用。但其对肺功能的影响未见报道。　　 氧化应激损伤是脓毒性休克重要发病机制之一，目前临床上尚无特效的抗氧化治疗药物。前期研究中，我们发现在LPS诱导脓毒性休克致ALI发生的过程中，存在严重的氧自由基损伤，而且早期液体复苏对肺脏的氧化应激损伤无明显改善作用。最近研究证实低浓度氢可以选择性中和羟自由基，改善氧化应激损伤，而且在缺血-再灌注损伤、炎性疾病、代谢性疾病、神经性疾病等动物模型中，氢分子都显示了较好的治疗效果。目前，氢气作为抗氧化剂在脓毒性休克领域研究甚少。　　 脓毒性休克时为了保证心、脑等重要器官的供血，血流出现重新分配，胃肠道的血流量较体循环减少更为明显，可出现严重的缺血、缺氧及再灌注损伤。胃肠道粘膜的损伤可激活大量炎性介质的释放，形成炎症介质的“瀑布效应”，最终导致MODS的发生。因此保护脓毒性休克过程中肠道功能，对改善脓毒性休克患者的预后具有重要意义。在前期实验中我们发现早期液体复苏联合2％氢气吸入对脓毒性休克中肺损伤具有明显的改善作用，但这种干预手段对肠道功能的作用尚未见报道。　　 因此本实验将利用脂多糖(LPS)诱导脓毒性休克致ALI大鼠模型，研究两种不同的早期液体复苏方案对肺功能的影响，从肺损伤角度评价早期与延迟应用去甲肾上腺素的液体复苏方案对脓毒性休克大鼠肺脏的作用;将早期液体复苏与2％氢气吸入作为联合干预手段，系统研究其在LPS诱导脓毒性休克过程中，在炎性介质、细胞凋亡、氧化应激等方面对肺脏和小肠功能的影响。　　 材料与方法　　 1、脓毒症休克模型建立　　 健康雄性Wistar大鼠(180～200g)，由中国医科大学实验动物部提供。75只Wistar大鼠随机分成5组，正常对照组（A组，n=15），脓毒性休克对照组(B组，n=15)，传统液体复苏方案组（C组，n=15），早期应用去甲肾上腺素组(D组，n=15)，早期液体复苏+2％氢气吸入组（E组，n=15）。10％水合氯醛(300mg/kg)经腹腔麻醉，气管切开接呼吸机辅助通气，呼吸频率100次/分，潮气量10 ml/kg，A，B，C，D组吸入气体为空气，E组吸入气体为2％氢空混合气。左颈动脉穿刺，经压力传感器连接监护仪监测心率及平均动脉压(MAP);股静脉穿刺留置导管，以备给药及补液，电热器维持体温。除A组外，其余4组LPS15mg/kg缓慢静脉注射，建立脓毒性休克大鼠模型。　　 2、方法　　 (1)实验一:正常对照组（A组，n=15），脓毒性休克对照组（B组，n=15），传统液体复苏方案组（C组，n=15），早期应用去甲肾上腺素组（D组，n=15）。C组液体复苏方案:生理盐水10ml/kg/15min，30min后根据MAP水平，应用去甲肾上腺素(0.5-6μg/kg/min)，D组液体复苏方案:生理盐水10ml/kg/15min，同时应用去甲肾上腺素(0.5-6μg/kg/min)，维持MAP于正常水平。记录各组的生命体征、补液量及去甲肾上腺素的用量。模型建立2h后经颈动脉放血处死。留取动脉血行血气分析，肺组织HE染色，光镜下观察病理改变，透射电镜观察肺组织超微结构变化，检测肺组织中氧化还原指标(MDA、MPO、SOD)，ELISA检测血清和肺泡灌洗液中促炎介质:IL-6、IL-8、TNF-α表达水平。　　 (2)实验二:正常对照组（A组，n=15），脓毒性休克对照组（B组，n=15），早期液复苏组（C组，n=15），早期液体复苏+2％氢气吸入组（E组，n=15）。10％水合氯醛(300mg/kg)经腹腔麻醉，气管切开接呼吸机辅助通气，呼吸频率100次/分，潮气量10 ml/kg， E组吸入气体为2％氢空混合气，其余3组吸入气体为空气。左颈动脉穿刺，连接监护仪监测心率及平均动脉压(MAP);股静脉穿刺留置导管，以备给药及补液，电热器维持体温。除A组外，其余3组LPS15mg/kg缓慢静脉注射，建立脓毒性休克大鼠模型。液体复苏方案:生理盐水10ml/kg/15min，30min后根据MAP水平，应用去甲肾上腺素（0.5-6μg/kg/min），维持MAP于正常水平。记录各组的生命体征、补液量及去甲肾上腺素的用量。　　 模型建立成功后2h经颈静脉放血处死，留取动脉血行血气分析，HE染色观察肺组织病理改变，免疫组化观察Fas及Bcl-2在肺组织中的表达，Western-blot对肺组织中的Fas及Bcl-2进行半定量检测，检测肺组织中氧化还原指标(MDA、MPO、SOD)的表达，ELISA检测肺泡灌洗液中促炎介质:IL-6、IL-8、TNF-α表达水平。　　 (3)实验三:正常对照组(A组，n=15)，脓毒性休克对照组（B组，n=15），早期液复苏组（C组，n=15），早期液体复苏+2％氢气吸入组（E组，n=15）。E组吸入气体为2％氢空混合气，其余3组吸入气体为空气。液体复苏方案:生理盐水10ml/kg/15min，30min后根据MAP水平，应用去甲肾上腺素(0.5-6μg/kg/min)，维持MAP于正常水平。记录各组的生命体征、补液量及去甲肾上腺素的用量。大鼠于模型建立成功后2h，经颈动脉放血处死，留取动脉血行血气分析。留取小肠标本，HE染色观察小肠病理改变，并应用Chiu评分对小肠进行病理损伤半定量评分，透射电镜观察小肠细胞器改变情况，TBA法检测小肠组织中MDA、MPO表达，邻联二回香胺显色剂法检测血清DAO表达，ELISA检测血清中IL-6、IL-8、TNF-α表达水平。　　 3、统计学分析　　 所有数据以均数±标准（(x)±s）差表示，采用SPSS13.0统计软件分析，组间比较采用t检验，相关性分析采用pearson检验，P＜0.05具有统计学意义。　　 结果：　　 1、实验一　　 (1)补液量及血气结果:早期应用去甲肾上腺素（D组）与传统补液方案(C组)比较明显减少了达到目标血压所需的补液量，使氧合指数进一步改善，同时降低了血乳酸水平，组间二氧化碳分压值比较差异无统计学意义。　　 (2) HE染色和电镜结果显示早期应用去甲肾上腺素（D组）使肺水肿程度明显减轻，肺组织中炎性细胞侵润程度、肺泡充血情况及Ⅱ型肺泡上皮细胞的损伤程度均得到明显改善。　　 (3)早期应用去甲肾上腺素（D组）和传统补液方案（C组）均使血清和BALF中的促炎介质:IL-6、IL-8、TNF-α表达水平下调，但早期应用去甲肾上腺素使促炎介质表达下降更为明显，与传统补液比较差异具有统计学意义;两种补液方案对IL-6、IL-8、TNF-α在BALF和血清中的比值无影响。　　 (4)早期应用去甲肾上腺素（D组）仅使MPO表达较传统补液组及休克对照组明显下降，早期应用去甲肾上腺素（D组）和传统补液方案（C组）对SOD和MDA表达均无明显改善。　　 2、实验二　　 (1)早期液体复苏联合2％氢气吸入与单纯液体复苏比较降低了达到目标血压所需的液体量和去甲肾上腺素的用量;两种复苏方案均使血氧分压得到明显提高，降低了血乳酸水平，提高血PH值，氢气吸入联合液体复苏较单纯液体复苏对上述指标改善更为明显，组间比较差异具有统计学意义;各组间二氧化碳分压值比较无显著差异。　　 (2)脓毒性休克致ALI过程中氧化应激损伤严重，单纯液体复苏对氧化应激损伤改善不明显（MDA、MPO、SOD无明显变化）;早期液体复苏联合2％氢气干预明显降低了MDA、MPO表达水平，使SOD表达增加，减轻了氧化应激损伤。　　 (3)早期液体复苏联合2％氢气吸入与单纯液体复苏比较使肺W/D值明显下降，HE染色结果提示前者明显减轻了肺泡壁水肿情况，使肺组织病理损伤得到改善。　　 (4)免疫组化和Western-blot检测结果提示，LPS致脓毒性休克过程中肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞凋亡明显增加，表现在Fas表达增加而Bcl-2表达减少，两种复苏方案均使肺组织凋亡情况有所改善，但早期液体复苏联合2％氢气吸入比单纯液体复苏对肺组织细胞凋亡的改善情况更明显，组间比较差异具有统计学意义。　　 (5)早期液体复苏联合2％氢气吸入与单纯液体复苏比较进一步降低了BALF中促炎介质:IL-6、IL-8、TNF-α的表达，组间比较差异具有统计学意义。　　 3、实验三　　 (1)小肠HE染色结果提示休克对照组小肠绒毛水肿明显，大量粘膜上皮细胞脱落，绒毛和腺体明显受损，伴有中性粒细胞侵润，有的出现溃疡，小肠上皮细胞结构改变，肠壁水肿，Chiu评分明显高于正常对照组;早期液体复苏组与休克对照组比较，上述损伤进一步加重，Chiu评分进一步升高;早期液体复苏联合2％氢气吸入组上述小肠损伤情况明显减轻，Chiu评分明显降低，组间比较差异具有统计学意义。　　 (2)电镜结果提示早期液体复苏联合2％氢气吸入与单纯液体复苏比较细胞器损伤情况明显减轻。　　 (3)脓毒性休克组肠组织中MDA、MPO活力明显高于正常对照组(P＜0.05);早期液体复苏组使MDA、MPO活力进一步升高(P＜0.05);早期液体复苏联合2％氢气吸入组肠组织中MDA、MPO活力较脓毒性休克组和早期液体复苏组均明显下降(P＜0.05)。　　 (4)休克对照组中血清IL-6、IL-8、TNF-α表达水平较正常对照组明显升高(P＜0.05);早期液体复苏使促炎介质(IL-6、IL-8、TNF-α)水平降低(P＜0.05);早期液体复苏联合2％氢气吸入组与单纯液体复苏比较进一步降低了血清中促炎介质表达水平(P＜0.05)。　　 (5)休克对照组中血清DAO表达水平较正常对照组明显升高（6.54±0.68 vs4.32±0.33，P＜0.05）;早期液体复苏组使DAO水平进一步升高（6.89±0.77 vs6.54±0.68，P＜0.05）;早期液体复苏联合2％氢气吸入组肠组织中血清DAO水平较脓毒性休克组和早期液体复苏组均明显下降（5.14±0.44 vs6.54±0.68;5.14±0.44 vs6.89±0.77,P＜0.05）。　　 (6)休克对照组中小肠Chiu评分与血清IL-6、IL-8、TNF-α表达，小肠氧化损伤指标(MDA、MPO)、血清DAO及血乳酸值线性相关分析结果提示Chiu评分与各检测指标有正相关趋势，但与MDA和血乳酸水平的相关性具有统计学差异（P=0.001和P＜0.001），且与血乳酸值的相关系数最大(r=0.973)。　　 结论：　　 1、实验一　　 (1) LPS诱导脓毒性休克大鼠早期就并发急性肺损伤;　　 (2)传统液体复苏方案保证了有效的循环血量及组织灌注压，改善了微循环障碍，使氧分压及氧合指数升高，但却有加重肺水肿的趋势;　　 (3)早期应用去甲肾上腺素与传统液体复苏方案比较，在保证了有效的循环血量及组织灌注压，改善了微循环障碍的基础上，进一步减少了复苏所需液体量，使肺水肿程度减轻，减少了肺泡灌洗液及血浆中促炎介质表达水平，使氧合指数进一步升高，对肺损伤具有保护作用;　　 (4)早期液体复苏对脓毒性休克致肺损伤过程中氧化应激损伤指标改善不明显。　　 2、实验二　　 早期液体复苏联合2％氢气吸入与单纯液体复苏比较:　　 (1)减少了脓毒性休克复苏过程中达到目标血压所需的液体量，减轻了肺水肿，改善了肺氧合指数;　　 (2)减轻了脓毒性休克致ALI过程中肺组织氧化应激损伤程度;　　 (3)降低了肺泡灌洗液中促炎介质（IL-6、IL-8、TNF-α）的过度表达，减轻过度炎症反应导致的肺损伤;　　 (4)使肺组织中促凋亡蛋白Fas表达减少，抑制凋亡蛋白Bcl-2表达增加，减轻了肺组织细胞的凋亡，减轻了肺损伤程度，保护了肺功能。　　 3、实验三　　 (1) LPS致脓毒性休克过程中小肠功能受到严重损伤，表现为粘膜机械屏障损伤、氧化应激损伤和炎性介质的大量释放;　　 (2)早期液体复苏虽然使血浆中促炎介质:TNF-α、 IL-6和IL-8水平下降，但却加重了小肠粘膜屏障和氧化应激损伤;　　 (3)早期液体复苏联合2％氢气吸入治疗既降低了血浆中促炎介质水平，又减轻了脓毒性休克过程中小肠机械粘膜和氧化应激损伤，从不同层面保护了肠道功能;　　 (4)血清炎性介质水平并不能完全、准确反映休克过程中肠道局部损伤程度，血乳酸值与小肠损伤程度具有明显相关性，因其操作简单、快捷及无创伤性更适合用于评估休克中肠道损伤程度。