体细胞核移植技术在医疗、农业及畜牧业等诸多领域有重要的应用价值。尽管体细胞核移植已经在多种哺乳动物中获得成功,但仍有大多数克隆动物在孕期流产,只有少数能发育到妊娠末期或成年,即使是存活下来的克隆动物也多伴有器官发育异常,这些制约了体细胞核移植技术的广泛应用。在体细胞核移植过程中,体细胞核放弃已有的高度分化的体细胞模式,进行重编程形成全能性的胚胎模式,此过程称为表观重编程。目前认为,供体核的不完全重编程导致在发育过程中有重要作用的基因异常表达或没有表达是克隆效率低下的主要原因。DNA甲基化是基因组主要的表观修饰模式,是调节基因组功能的重要手段,DNA甲基化的程度对基因的表达有重要的调控作用。基因组印记是指来自双亲的等位基因的差异性表达,即来自亲本的等位基因或染色体在发育过程中产生专一性的加工修饰,导致后代细胞中两个亲本来源的等位基因有不同的表达活性,具有这种现象的基因称为印记基因。Dlk1-Gtl2印记区域的印记基因参与胚胎和胎盘的生长发育调控,该印记区域在各个物种中高度保守。目前,Dlk1-Gtl2印记区域在人和鼠中研究的比较多,由于基因序列的限制,该区域在牛中研究的很少。为了研究Dlk1-Gtl2印记区域在体细胞核移植牛中的DNA甲基化状态,首先采用RACE方法得到了牛Gtl2基因的全序列,结果显示牛Gtl2基因存在可变剪切,并且没有发现与Kozak规则相匹配的翻译起始序列,推测其可能是一种非编码的RNA。根据NCBI上已知的牛Dlk1和已获得的牛Gtl2 cDNA序列,应用NCBI/Blast程序进行序列比对,确定了Dlk1-Gtl2印记区域在牛21号染色体上的位置以及Gtl2 DMR和IG-DMR区域。亚硫酸氢盐测序法是一种可靠性及精确度很高的方法,能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态。为了探求核移植过程中DNA甲基化的表观重编程是否充分,本试验利用亚硫酸氢盐测序法分析了Gtl2 DMR、IG-DMR和Dlk15′启动子在出生48 h内死亡的克隆牛和自然繁殖牛肺脏中的DNA甲基化状态。结果显示,Gtl2 DMR甲基化程度在克隆牛和自然繁殖牛肺脏中都较高,且没有显著差异;体细胞核移植牛中IG-DMR甲基化程度较低,与正常对照组相比差异显著(P < 0.05);而Dlk1 5′启动子区在体细胞核移植牛表现出高甲基化,与正常对照组相比差异显著(P < 0.05)。由此可见,IG-DMR和Dlk1 5′启动子在体细胞核移植牛肺脏中出现了甲基化重编程紊乱,这种异常甲基化可能造成印记错误从而影响个体器官的正常发育,可能是导致克隆效率低下和克隆动物器官发育异常的原因之一。