第一部分大鼠骨髓间充质干细胞的分离、纯化及鉴定目的:作为一种多能干细胞——骨髓间充质干细胞(BMSCs),因其具有取材简便、易于体外分离培养与扩增、具有自我更新复制、多向分化的潜能以及自体移植无免疫排斥等优点已成为常见的“种子细胞”,被广泛应用于组织工程研究。众所周知,BMSCs并不属于无限传代的细胞系,因此在研究和应用BMSCs时,首先需要将BMSCs从供体中提取、分离,经过培养、纯化及鉴定后,方可用于后续的实验研究中。常见的关于BMSCs的分离方法包括有贴壁分离筛选法、梯度密度离心法、流式细胞仪或免疫磁珠分选法等。其中,贴壁分离筛选法操作简便,且对细胞的损伤相对较小,是研究者常用的比较经典的分离方法。基于此,本研究首先采用贴壁分离筛选法对BMSCs进行分离,经培养、纯化及扩增后对细胞从以下三个方面进行鉴定:(1)倒置相差显微镜下观察培养细胞的生长特点;(2)通过流式细胞术对所培养细胞表面分子CD29、CD90以及CD45的表达情况进行联合检测;(3)对所培养细胞进行体外诱导,使之定向向骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞方向分化,鉴定其多向分化能力。方法:本研究所需的BMSCs均取自3周龄清洁级SD大鼠的长骨骨髓,采用全骨髓贴壁分离筛选法将BMSCs进行分离、提取,经纯化扩增培养后对所培养的细胞从以下三个方面进行鉴定:1倒置相差显微镜下观察培养细胞的生长特点。2通过流式细胞术对所培养细胞表面分子CD29、CD90以及CD45的表达情况进行联合检测。3对所培养细胞进行体外诱导,使之定向向骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞方向分化,鉴定其多向分化能力。结果:1培养过程中BMSCs的形态变化特征:初接种至培养瓶中的细胞呈悬浮状态,形态为圆球形,细胞数目较多,大小较为均一;约12h后可见有部分细胞开始贴壁,4d后可见细胞由圆形转变为不规则形,胞核多居中、饱满,部分细胞出现长短不均一的突起,大约1w时,细胞融合可达90%以上,细胞进一步伸展,多数细胞形似成纤维细胞。传代后细胞生长速度变快,形态及排列逐渐变为规则、均一的长梭形,长势良好。2 BMSCs细胞表面联合抗原鉴定结果:造血干细胞标志CD45的阳性率为1.3%,而细胞纤维连接受体CD29、细胞黏附分子CD90的阳性率则可分别高达94.3%、95.9%。这说明,本研究所分离、培养的细胞,经传代纯化后表面抗原的表达符合BMSCs的特征。3对BMSCs进行多向分化潜能的鉴定结果:P3代BMSCs经成骨诱导培养基培养21d后,茜素红染色结果显示,部分细胞的胞质或胞外基质可见有红色的钙化团或钙化点,而胞核多为空染,部分细胞之间的连接处可见有骨细胞突起样结构;P3代BMSCs经成脂诱导培养基培养14d后,用油红O染色法进行检测显示细胞胞质呈橘红色;P3代BMSCs经成软骨诱导培养基培养14d后,经阿尔新蓝染色检测,结果显示细胞胞质可被染成紫蓝色。以上结果均表明,所培养细胞在特定的诱导条件下能够分别向骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞方向分化,其具有多向分化的潜能。结论:经全骨髓贴壁分离筛选法后成功的分离、培养、扩增及鉴定了所培养的细胞为大鼠BMSCs。第二部分TGF-β1体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化目的:转化生长因子β1(TGF-β1)对细胞的发育及免疫反应等具有双重调控作用,即在不同浓度水平或不同的细胞微环境下TGF-β1会表现出相异的效果。鉴于此,本实验采用不同浓度的TGF-β1作为诱导剂,对BMSCs作体外诱导,使其定向分化为心肌细胞(CMs)或心肌样细胞(CLCs),并从形态学、基因表达、蛋白表达及超微结构等多个层面多水平观察并鉴定诱导分化的有效性,从而探索体外BMSCs诱导分化为心肌细胞的新方法和条件,为细胞移植临床治疗急性心肌梗死(AMI)等缺血性心脏病提供理论依据。方法:1实验分组:选取细胞生长状态良好、形态较均一的P2代SD大鼠BMSCs,采用完全培养基常规培养48h后,首先用0.01mol/L的PBS浸洗3次以清除残留培养基。随后,根据加入诱导剂的不同,将其分为以下5组:(1)A组:加入含5-AZA(终浓度为250 ng/mL)的IMDM完全培养基进行诱导培养;(2)B组:加入含TGF-β1(终浓度为2ng/mL)的IMDM完全培养基进行诱导培养;(3)C组:加入含TGF-β1(终浓度为5ng/mL)的IMDM完全培养基进行诱导培养;(4)D组:加入含TGF-β1(终浓度为10 ng/mL)的IMDM完全培养基进行诱导培养;(5)E组:即空白对照组,在培养的过程中不加任何诱导剂。各组在诱导培养72h以后,弃除原培养基,换以正常培养基继续培养至28d。在培养的过程持续对各组所培养的细胞进行形态学的观察。2 BMSCs经诱导分化后的检测及鉴定:(1)免疫细胞化学染色法检测各组细胞心肌相关标记物Desmin、Tm、Cx43及cTnI蛋白的表达;(2)RT-qPCR检测各组细胞GATA-4、Nkx2.5及α-MHC基因的表达情况;(3)Western blot检测诱导培养至28d的细胞GATA-4、Nkx2.5蛋白的表达情况;(4)透射电镜观察各诱导组BMSCs培养至28d时的超微结构;(5)免疫荧光双标染色法检测各组细胞Desmin、cTnI蛋白的共表达情况。结果:1培养期间各组细胞形态学变化:E组细胞呈规则、均一的长梭形,形态类似于成纤维细胞,排列较为规整。与E组细胞相比,各诱导组(A、B、C、D组)细胞随着培养时间的延长出现了一些形态学的改变,但各诱导组之间细胞的形态差异不显著。诱导组细胞在诱导培养后的3d-7d与E组的形态接近,以梭形细胞为主,随着时间的延长,逐渐转变成类长柱形细胞。细胞间于14d开始出现连接,至28d时诱导组细胞体积略变小,排列紧密,生长方向趋于一致,呈条梭状。2免疫细胞化学染色结果:A、B、C、D组细胞均阳性表达Desmin、Tm、Cx43及cTn I。A、B、C、D组与E组以上各标记物的阳性表达均具有显著性差异(P<0.05)。在不同的诱导组之间,C组以上各标记物的IA值均最强。C组Desmin、Tm、Cx43及cTnI的表达均与B组差异具有统计学意义(P<0.05),但与A组的差异均不具有显著性。此外,C组Desmin、cTnI的表达还与D组的差异具有显著性(P<0.05)。3 RT-qPCR检测结果:各组细胞均不表达α-MHC基因,但可表达GATA-4、Nkx2.5基因,且不同组别在不同的时间点GATA-4、Nkx2.5基因的表达趋势并不完全一致。以28d作为时间点,比较各组GATA-4、Nkx2.5基因的表达情况,结果显示,A、B、C、D组GATA-4、Nkx2.5基因的相对表达均高于E组,且C组的相对表达均最高。C组GATA-4mRNA相对表达是E组的3.3倍,Nkx2.5 mRNA相对表达是E组的2.7倍,差异均具有统计学意义(P<0.05)。4 Western blot检测结果:A组、C组及E组均有GATA-4、Nkx2.5蛋白的表达,且A组、C组GATA-4、Nkx2.5蛋白的表达均显著高于E组(P<0.05),但A组与C组间的差异不具有统计学意义。5透射电镜观察结果:培养至28d时各诱导组细胞的超微结构类似,即胞核为卵圆形,居中,胞质内均可见较多滑面内质网与线粒体、糖原及核糖体等细胞器,还可见较多平行排列的肌丝,类似于CMs的超微结构特点。6免疫荧光双标染色结果:分化后的细胞胞质内可见有Desmin和cTnI蛋白的共表达,A、C组Desmin和cTnI共表达的荧光值均高于D组,且C组与D组的差异具有统计学意义(P<0.05)。B组Desmin和cTnI共表达的荧光值则低于D组,但二者之间差异不具有统计学意义。结论:BMSCs在体外培养过程中可经TGF-β1诱导获得心肌分化的表型,且5ng/mL可能为最佳诱导浓度。第三部分外源基因TGF-β1转染大鼠骨髓间充质干细胞通过抑制Wnt/β-catenin信号通路启动心肌分化目的:在心血管领域相关基因治疗的科研中,慢病毒作为载体的基因修饰己被广泛应用。TGF-β1是一种可调节细胞发育、增殖、分化、修复及凋亡的细胞因子,对基质的形成、肿瘤发生、间质纤维化等亦起到重要的调节作用。Wnt信号通路包括依赖于β-catenin的Wnt/β-catenin经典通路和不依赖β-catenin的非经典通路,是一个呈高度保守的信号传导通路,其家族成员通常是通过自分泌或旁分泌作用与位于细胞膜上的特异性受体结合,从而激活胞内的信号通路,调节靶基因的表达。大量研究表明,Wnt信号通路在许多生理过程(如心脏及神经系统发育,细胞的增殖及迁移,干细胞分化、组织的形成等)及病理过程(如肿瘤发生和转移等)中起着至关重要的调节作用。有研究证实Wnt/β-catenin与TGF-β信号通路亦存在一定的交互作用。基于此,本研究拟采用慢病毒作为过表达载体将外源性基因TGF-β1转染大鼠BMSCs,探讨其在诱导BMSCs心肌分化过程中与Wnt/β-catenin信号通路的作用关系及相关机制,为实现BMSCs高效的心肌细胞分化提供实验依据。方法:1 BMSCs培养至P3代,实验进行分组:A组(Lenti-TGF-β1-GFP慢病毒转染组)、B组(Lenti-对照-GFP慢病毒转染组)、C组(BMSCs空白对照组)。C组细胞不进行基因转染相关的操作。A、B组按照实验分组对所培养细胞进行转染,测定最佳MOI值。2 Western blot检测转染96h后各组细胞TGF-β1蛋白的表达情况。3 ELISA法检测各组细胞培养基中TGF-β1含量的差异。4运用免疫细胞化学染色法检测转染28d后各组细胞Desmin和cTnI蛋白的表达情况。5 Western blot检测BMSCs经慢病毒转染后β-catenin、GSK3β、p-GSK-3β、c-Myc、cyclinD1及MMP-7蛋白的表达情况。6免疫荧光染色检测转染TGF-β1后β-catenin在BMSCs内定位的变化。7 RT-qPCR检测BMSCs经慢病毒转染后c-Myc、cyclinD1及MMP-7基因的表达情况。8 Western blot法检测Wnt通路激活剂LiCl对BMSCsβ-catenin及p-β-catenin蛋白表达的影响。结果:1预实验测定最佳MOI值为150,A组及B组在慢病毒转染24h后,出现了少许悬浮的死细胞,细胞的形态变化不明显。在转染96h后,荧光转染率较高。C组细胞在培养过程中无细胞死亡,未出现荧光。2 BMSCs经慢病毒转染96h后,Western blot检测各组细胞TGF-β1蛋白的表达情况,结果显示,B组、C组细胞无TGF-β1蛋白的表达而A组则高表达TGF-β1蛋白。3 ELISA法检测结果显示,TGF-β1转染组培养基上清中TGF-β1的浓度为2.055 ng/mL,而空白对照组、空质粒转染组及TGF-β1诱导组培养基上清中TGF-β1的浓度则分别为1.245 ng/mL、1.395 ng/mL和1.865ng/mL,以上三组与TGF-β1转染组的差异均具有统计学意义(P<0.05)。4免疫细胞化学染色结果表明,B组及C组细胞Desmin和cTnI蛋白均为弱阳性或阴性表达,而A组细胞则均为阳性或强阳性表达。经统计学分析,A组与B组、C组以上各标记物的阳性表达差异均具有显著性(P<0.05)。5 Western blot检测结果显示,与空白对照组相比,转染组BMSCs的细胞质β-catenin蛋白表达未见明显变化,而细胞总的β-catenin蛋白以及细胞核中的β-catenin蛋白均显著减少(P<0.05)。此外,转染组GSK-3β蛋白的表达量未见明显变化,而p-GSK-3β及下游靶基因c-Myc、cyclinD1及MMP-7蛋白的表达量均显著下降(P<0.05)。6免疫荧光染色结果显示,转染TGF-β1后,BMSCs细胞核内的β-catenin较空白对照组明显减弱,说明转染TGF-β1后由胞质向胞核进行核位移的β-catenin减少。7 RT-qPCR检测结果显示,各组细胞在7d、14d及28d均可表达c-Myc、cyclinD1及MMP-7基因。以14d作为时间点,A组和B组c-Myc、cyclinD1及MMP-7基因的相对表达量均低于C组。其中,A组c-Myc mRNA相对表达量是C组的61%,cyclinD1 mRNA相对表达量是C组的68%,差异均具有统计学意义(P<0.05)。B组c-Myc、cyclinD1基因的相对表达量与C组之间均无显著性差异(P>0.05)。MMP-7基因在A组、B组的相对表达量与C组之间均无显著性差异(P>0.05)。8 Western blot法检测Wnt通路激活剂LiCl对BMSCsβ-catenin及p-β-catenin蛋白表达的影响,结果显示,与空白对照组相比,单纯TGF-β1转染组BMSCsβ-catenin蛋白表达降低,而p-β-catenin蛋白的表达明显增高(P<0.05);而与空白对照组相比,单纯Wnt通路激活剂组以及TGF-β1转染+Wnt通路激活剂组BMSCsβ-catenin蛋白表达均增高,而p-β-catenin蛋白的表达均明显降低(P<0.05)。结论:1成功应用慢病毒作为过表达载体介导TGF-β1基因转染至SD大鼠BMSCs,转染效率较高,细胞死亡率低,且实现了稳定转染。转染外源性基因TGF-β1后的BMSCs能够定向分化为CMs或CLCs。2 TGF-β1促进BMSCs向CMs分化是通过促进细胞内β-catenin的磷酸化降解、干扰β-catenin从细胞质向细胞核移位进而阻断Wnt/β-catenin信号通路来实现的。3 TGF-β1促进BMSCs向CMs分化是通过抑制Wnt信号通路的下游靶基因——c-Myc、cyclinD1及MMP-7的表达来实现的。