【摘 要】
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目的华蟾毒它灵（CBF）是中医抗癌药物蟾蜍的提取物,被证实对许多肿瘤具有抑制作用,但其作用机制尚不明确。本课题应用现代分子生物学方法对华蟾毒它灵抑制肝癌细胞代谢及增殖作用机制进行研究,为临床开展基于华蟾素为基础的肿瘤治疗提供理论依据。方法1.体外建立肝癌细胞株Hep G2、SMMC-7721及LM3培养细胞模型。通过CCK-8法、克隆形成实验、流式细胞术检测等细胞生物学实验技术观察CBF对肝癌细胞
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目的华蟾毒它灵（CBF）是中医抗癌药物蟾蜍的提取物,被证实对许多肿瘤具有抑制作用,但其作用机制尚不明确。本课题应用现代分子生物学方法对华蟾毒它灵抑制肝癌细胞代谢及增殖作用机制进行研究,为临床开展基于华蟾素为基础的肿瘤治疗提供理论依据。方法1.体外建立肝癌细胞株Hep G2、SMMC-7721及LM3培养细胞模型。通过CCK-8法、克隆形成实验、流式细胞术检测等细胞生物学实验技术观察CBF对肝癌细胞增殖、周期阻滞及凋亡的作用。2.通过18F-FDG摄取实验、质谱方法分析等实验观察CBF对肝癌细胞糖代谢、脂代谢、及细胞膜流动性的作用。3.通过Western blotting、q PCR等分子生物学技术观察CBF对Hep G2脂代谢相关分子SREBP1、SCD1及下游靶基因的作用。4.建立BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型,在体评估CBF对肝癌移植瘤的治疗效果。结果1.CBF可抑制肝癌细胞的增殖,并降低其脂质合成。Hep G2细胞株对CBF的敏感性高于其它肝癌细胞株（24h的IC50值为0.22μM）;CBF通过抑制Hep G2细胞DNA合成,诱导G2-M期细胞周期阻滞,并促进细胞凋亡,进而影响增殖。与此同时,CBF可降低Hep G2的甘油三脂水平、脂滴形成能力及细胞膜流动性。2.CBF直接与SREBP1蛋白残基位点在肝癌细胞内相互结合,抑制SREBP1转录活性及下游基因的转录翻译,经0.1μM,0.2μM CBF处理肝癌细胞后,SREBP1转录活性分别降至0.6547±0.0242、0.2964±0.0207（P＜0.01,P＜0.001）。当肝癌细胞敲低SREBP1后,用药后发现,NC组的EDU标记的绿色荧光细胞数量、细胞克隆率、脂滴红色荧光强度逐渐降低,与药物剂量呈依赖性（P＜0.001,P＜0.001）,Si-SREBP1组各组EDU标记的绿色荧光细胞数量、细胞克隆率、脂滴红色荧光强度均减少,但是各组之间无明显差异。当过表达SREBP1后,结果与上述情况相反。3.质谱分析CBF处理肿瘤细胞的代谢产物,可发现细胞内单不饱和脂肪酸像棕榈油酸（C16:1）、油酸（C18:1）、神经酸（C24:1）等多种单不饱和脂肪酸的水平较DMSO组明显下降（P＜0.01）,且SCD1蛋白及m RNA水平亦是明显下降的（P＜0.05）;CBF处理Si SCD1组后,各组细胞膜的流动性均降低,细胞增殖能力明显下降,但Si SDC1各组之间无明显差异。当过表达SCD1后,药物处理后各组细胞膜的流动性,细胞增殖能力明显增加,且SCD1-OE各组之间差异明显,与CBF处理Control各组相比较（P＜0.05）。4.敲低SREBP1,过表达SCD1,CBF呈剂量依赖性调节脂滴水平,膜流动性与增殖;过表达SREBP1,敲低SCD1,CBF仍呈剂量依赖性调节脂滴水平,膜流动性与增殖。当药物处理敲除SERBP1联合过表达SCD1组,发现各组的表型恢复到Control组水平;当药物处理过表达SCD1组,发现CBF能够明显调节肝癌细胞的增殖,脂代谢及膜流动性表型。CBF可在体延缓Hepa-1-6肝癌细胞移植瘤的生长,HE染色结果显示,安慰剂组肿瘤组织内可见许多细胞核分裂及异质性细胞,然而CBF组肿瘤组织可见中性粒细胞、细胞碎片,细胞核完整,形态规则,显示出大量弥漫性坏死状态。免疫组化结果可见,与安慰剂治疗肿瘤模型鼠相比,CBF治疗Hepa-1-6移植瘤组织内SREBP1、SCD1、Ki67染色信号强度明显降低。结论1.CBF可以抑制肝癌细胞增殖及脂质代谢。2.CBF可直接靶向SREBP1,抑制肝癌细胞增殖与脂质代谢。3.CBF可通过SCD1抑制肝癌细胞的细胞膜流动性与增殖。4.CBF可能通过SREBP1、SCD1双靶点抑制肝癌细胞的脂质合成、细胞膜流动性与增殖。
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