microRNA在胃癌器官特异性转移中的作用及机制研究

来源 :第四军医大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:syf1122
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【背景】胃癌是我国乃至亚洲死亡人数最多的恶性肿瘤之一。肝脏和腹膜转移是胃癌转移的主要方式,也是导致胃癌治疗失败和患者死亡的重要原因。随着分子生物学的发展及双向电泳、质谱技术及基因芯片等研究方法的广泛应用,越来越多肿瘤转移相关的分子标志物被发现,但是决定胃癌发生器官特异性转移的分子机制仍不明确,现有的肿瘤分子标记物和方法学不能区别肿瘤细胞是否具有转移潜质,因此寻找胃癌肝脏/腹膜转移的特异性分子标志物有助于更有效的诊断、治疗进展期胃癌。为了探讨胃癌器官特异性转移相关的分子机制,我实验室前期采用国际通用的筛选方法,在裸鼠体内应用人类胃癌GC-9811细胞建立了胃癌肝脏/腹膜特异性转移的细胞模型。微小RNA (microRNA)是一类广泛存在于动植物体内、长度22nt左右的内源性非编码RNA,其编码基因占到人类总编码基因的1%,是最大的一类调控分子。miRNA通过直接降解靶mRNA或者抑制蛋白质翻译来负性调控靶基因的表达,目前已知人体内存在的miRNA分子有800多个,足以调控人体内超过1/3的蛋白编码基因的表达。miRNA已被证实广泛参与包括肿瘤的发生、发展和转移在内的多种生理病理过程。但应用MicroRNA技术研究胃癌的转移特别是胃癌器官特异性转移的分子机制,国内外还少有相关报道。【目的】探讨miRNA在胃癌器官特异性转移中的作用及其分子机制,以期更全面的阐明胃癌转移的机制,并为寻找新的进展期胃癌治疗靶点提供理论依据。【方法】1.通过miRNA芯片检测胃癌肝脏/腹膜特异性转移细胞系GC9811-P及其亲本细胞GC9811的miRNA表达谱,找出差异表达的miRNA分子;2.收集胃癌转移临床标本,利用实时荧光定量PCR法对miRNA芯片结果进行验证;3.将miR-106b的特异性寡核苷酸前体瞬时转染入胃癌细胞SGC7901、AGS中,上调该miRNA分子的表达;4.通过细胞划痕试验验证miR-106b对胃癌细胞SGC7901、AGS体外迁移能力的影响;5.通过Transwell试验观察miR-106b对SGC7901、AGS细胞体外侵袭能力的影响;6.利用生物信息学网站和靶基因预测软件寻找miR-106b可能调控的靶基因;双荧光素酶报告基因实验对候选靶基因进行验证;7.用Western blot、RT-PCR明确miR-106b对其靶基因TIMP2的调控作用及两者在胃癌细胞及临床胃癌组织中的表达相关性;8.通过裸鼠体内转移实验分析miR-106b对胃癌细胞SGC7901器官特异性转移的影响。【结果】1.芯片筛选得到71个miRNA分子在胃癌高转移潜能细胞系GC9811-P和其亲本细胞GC9811中差异表达(>2倍):在GC9811-P细胞中表达升高的miRNAs共44个,包括let-7b, miR-15b, miR-93, miR-106b, miR-107, miR-130和miR-342-3p等;表达降低的miRNAs有27个,包括let-7i,miR-135a*和miR-140-3p等。其与胃癌转移的关系大多数未见报道;2. Realtime-PCR结果显示:miR-106b在10例人类胃癌转移组织中的表达较原发癌显著增高,与芯片结果一致;3.体外细胞划痕实验表明,上调miR-106b的表达,SGC7901及AGS细胞的体外迁移能力显著增加;4.Transwell实验同样证实,上调miR-106b的表达可显著增强SGC7901及AGS细胞体外侵袭能力;5.生物信息学预测的众多miR-106b可能的靶基因中,包括尚未见报道的转移相关基因TIMP2,报告基因实验证实其为miR-106b的靶基因;6.与对照细胞相比,转染miR-106b特异前体的SGC7901及AGS细胞的TIMP2蛋白水平明显降低,而mRNA水平则无显著差异。TIMP2在组织中的表达与miR-106b负相关; 7.裸鼠体内实验表明,人工合成的miR-106b拟似物(mimics)可以增强胃癌细胞SGC7901的肝脏特异性转移能力。【结论】1. miRNA分子在胃癌肝脏/腹膜特异性转移细胞和其亲本细胞中差异表达,可能参与了胃癌器官特异性转移;2. miR-106b增强胃癌细胞体外转移能力,其可能的分子机制是:miR-106b负性调控靶基因TIMP2的表达,从而上调下游转移相关基因基质金属蛋白酶(MMPs)的表达,从而使胃癌细胞局部侵袭和转移能力增强;3. miR-106b可以增加胃癌细胞SGC7901在裸鼠体内的肝脏膜特异性转移。
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