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牦牛(Bos grunniens)是生存于青藏高原的特有物种,对低氧、强紫外线的高原环境具有很强的适应性,可能形成了保护中枢神经系统免受低氧损伤与氧化损伤的特殊机制。金属硫蛋白(MTs)是一类低分子量、高半胱氨酸含量和富含金属的细胞质蛋白,具有重金属解毒,清除自由基,保护脑细胞免受缺血缺氧性脑损伤,以及促进多种脑病理损伤修复等作用。推测金属硫蛋白可能对牦牛适应低氧、强紫外线的高原环境发挥了重要作用,具有相应的分子遗传基础,然而牦牛MT-Ⅲ和MT-Ⅳ基因的研究尚未见报道。本论文采用RT-PCR、5’RACE等基因克隆技术首次克隆了牦牛MT-Ⅲ转录区序列和MT-Ⅳ基因序列,采用生物信息学方法对牦牛MT-Ⅲ和MT-Ⅳ蛋白质性质和结构进行了预测,并构建了MT-Ⅲ原核表达体系,主要获得以下结论:1、牦牛MT-Ⅲ基因转录区序列全长1484bp(GenBank Accession No.:DQ492300和EU653285),5’非翻译区、外显子1、内含子1、外显子2、内含子2、外显子3和3’侧翼区长度依次为56bp、31bp、232bp、66bp、817bp、110bp和172bp。2、牦牛MT-Ⅲ基因编码区长207bp,编码68个氨基酸,其中Cys占27.9%,不含芳香簇氨基酸。与MT-Ⅰ和MT-Ⅱ相比,在N端第四个氨基酸后插入一个苏氨酸,在C端插入了GEGAEA序列。牦牛MT-Ⅲ蛋白质分子量6.94KDa,没有明显的疏水区,没有跨膜结构域,不存在信号肽,是一种细胞内蛋白质。3、与人和鼠相比,牦牛MT-Ⅲ基因编码区第88位的碱基T突变成A,使氨基酸序列中第30位保守的Cys被Ser代替,这可能对牦牛MT-Ⅲ的结构和功能产生一定的影响,有待深入研究。4、牦牛MT-Ⅳ基因三个外显子和内含子全长2099bp(GenBank Accession No.:EU665491),三个外显子长度分别为31bp、66bp和92bp,二个内含子长度分别为1392bp和518bp。编码区长189bp,编码62个氨基酸,其中Cys 20个,不含芳香簇氨基酸。与MT-Ⅰ和MT-Ⅱ相比,在N端第四个氨基酸后插入了一个谷氨酸。MT-Ⅳ蛋白质分子量6.25KDa,没有明显的疏水区,没有跨膜结构域,不存在信号肽,是一种细胞内蛋白质。5、研究表明MT-ⅣmRNA在不存在复层扁平鳞状上皮细胞的器官肝脏、脾脏、脑和脑垂体中也有表达,表明MT-Ⅳ可能不仅限于在复层扁平鳞状上皮细胞中表达,这有待于深入研究。6、牦牛MT-Ⅲ和MT-Ⅳ编码区序列和氨基酸序列与其它哺乳动物的高度同源,在进化上高度保守,建立的系统进化树与比较形态学和生理学分类结果一致。但非编码区序列同源性很低,这些序列可能存在物种特异性。7、以鼠MT-Ⅲ三级结构为模板,预测出了牦牛MT-Ⅲα结构域的三级结构,表明牦牛MT-Ⅲ蛋白质在第43-46氨基酸间形成α螺旋;以兔MT-Ⅱ三级结构为模板,预测出了牦牛MT-Ⅳ三级结构,MT-Ⅳ没有规则的二级结构,与其它MTs来型不同,MT-Ⅳ两个结构域连接序列为RKS。8、采用pET-42a(+)表达载体,BamH I、XHoI酶切,构建了pET-42a(+)-MT-Ⅲ融合表达重组质粒,转化E.Coli BL21(DE3)plysS表达菌,建立了IPTG诱导表达MT-Ⅲ原核表达体系。