[背景]缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury, IRI)是指组织缺血缺氧后恢复血流与氧供,不仅未能使器官组织功能恢复,反而加重组织器官功能障碍和结构损伤；其机制复杂,它会导致组织直接损伤,并启动一连串的导致炎症、细胞死亡甚至器官衰竭的有害细胞反应。IRI对肝脏和胆道系统均造成不同程度的损伤,而胆道系统对IRI较肝实质更敏感,因此胆道是冷、热IRI重要的靶器官。IRI主要损伤胆道周围血管丛(peribiliary vascular plexus, PBVP),引起PBVP微血栓形成、内皮细胞损伤,致胆道微循环障碍；继发的胆管炎症、水肿、纤维化再压迫邻近PBVP,形成恶性循环。Notch信号通路直接接受邻近细胞的信号并传到细胞核,激活相关转录因子的表达,调控多种细胞增殖、分化、凋亡,调节血管再生。多项通过建立大鼠心、肾等器官缺血再灌注模型的研究认为,Notch通路具有调节缺血器官血管再生的能力,对预防IRI有重要意义。但其在缺血再灌注损伤后PBVP再生中的作用尚需进一步研究。[目的]γ-分泌酶抑制剂DAPT (N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenyl-glycine t-butyl ester)是Notch信号转导途径的特异性阻断剂,能够有效地抑制Notch信号通路。本研究通过建立大鼠原位自体肝移植胆道缺血再灌注损伤模型,采用DAPT对大鼠进行预处理,分析大鼠胆道缺血再灌注后Notch信号通路相关蛋白分子在汇管区的表达情况、血清转氨酶、组织学病理变化(汇管区血管再生情况),探讨Notch信号通路在胆道缺血再灌注损伤后PBVP再生中的作用,为肝移植术后胆道并发症的防治提供新的理论基础和实验依据。[方法]1.参照周杰等介绍的方法,建立大鼠原位自体肝移植胆道缺血再灌注损伤模型。2.SPF级健康成年雄性SD大鼠48只,体重250-280g,随机分为3组,分别为假手术组(SO)、缺血再灌注组(IRI)、DAPT预处理组(DAPT),IRI组、DAPT组无肝期为18min,门静脉复流后仍夹闭肝动脉30min,每组按再灌注时间不同随机分为3天、7天两个亚组,即SO3d、SO7d、IRI3d、IRI7d、DAPT3d、DAPT7d,每个亚组n=8；SO组：术前2h每只大鼠予以腹腔注射1ml生理盐水,仅常规进入腹腔后游离肝周韧带,结扎离断较粗的膈下静脉、右肾上腺上静脉,游离肝下下腔静脉至右肾静脉水平,游离肝十二指肠韧带,显露肝门结构,不予血管夹闭阻断,关闭腹腔；IRI组为阳性对照组,术前2h每只大鼠予以腹腔注射生理盐水,剂量为1m1/只,然后按建模方法行胆道缺血再灌注处理;DAPT干预组：术前2h每只大鼠予以腹腔注射DAPT 4.3mg/kg,剂量为1m1/只,然后行胆道缺血再灌注处理。各组动物经缺血再灌注后处死,腹主动脉采血5ml及获取新鲜肝组织,检测ALT、GGT、AKP、STB评价肝功能,肝组织HE染色观察肝组织受损程度,电镜观察胆道上皮、血管内皮细胞超微结构变化,免疫组化法检测汇管区相关蛋白表达情况。[结果]1.共成功制作大鼠自体原位肝移植胆道缺血再灌注模型32例。2.肝功能变化：与SO组相比较,IRI3d、DAPT3d、DAPT7d亚组血清ALT、ALP、 GGT、TBIL水平均明显升高,高于SO组相同时间点亚组,差异有统计学意义(P<0.05), IRI7d亚组ALP、GGT、TBIL水平明显高于SO7d亚组,差异有统计学意义(P<0.05),IRI7d亚组ALT水平稍高于SO7d亚组,差异无统计学意义(P>0.∞);与IRI组比较,DAPT3d、DAPT7d亚组血清ALT、ALP、GGT、 TBIL水平均明显高于IRI组相同时间点亚组,差异有统计学意义(P<0.05)。组内亚组间比较：SO3d和S07d亚组间血清ALT、ALP、GGT、TBIL水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；IRI组和DAPT组3d亚组的血清ALT、ALP、 GGT、TBIL水平明显高于7d亚组,差异有统计学意义(P<0.05)。3汇管区CD34阳性表达的微血管密度(MVD)的变化：与SO组相比较,IRI3d、 IRI7d、DAPT7d亚组汇管区MVD明显高于SO组相同时间点亚组,差异有统计学意义(P<0.05),DAPT3d亚组与SO7d亚组的MVD差异无统计学意义(P>0.05)；与IRI组比较,DAPT3d、DAPT7d汇管区MVD明显低于IRI组相同时间点亚组,差异有统计学意义(P<0.05)；IRI组、DAPT组3d亚组的MVD水平明显低于7d亚组,差异有统计学意义(P<0.05)。4汇管区D114、Notch1、Hes1的表达情况4.1 D114的表达情况：与SO组相比,IRI3d亚组的汇管区D114蛋白水平明显升高,高于SO3d亚组,差异有统计学意义(P<0.05),IRI7d、DAPT3d、DAPT7d亚组与SO组相同时间点亚组D114蛋白水平的差异无统计学意义(P>0.05)；IRISd亚组D114蛋白表达水平明显高于DAPT3d组,差异有统计学意义(P<0.05),而IRI7d亚组与DAPT7d亚组D114蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05)。4.2 Notchl的表达情况：与SO组相比较,IRI3d、IRI7d、DAPT3d亚组汇管区Notch1蛋白表达水平明显高于SO组相同时间点亚组,差异有统计学意义(P<0.05), DAPT7d亚组与SO7d亚组的Notch1蛋白表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；与IRI组比较,DAPT3d、DAPT7d汇管区Notch1蛋白表达水平明显低于IRI组相同时间点亚组,差异有统计学意义(P<0.05);SO3d和S07d亚组间Notch1蛋白表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；IRI组、DAPT组3d亚组的Notch1水平明显高于7d亚组,差异有统计学意义(P<0.05)。4.3 Hes1的表达情况：与SO组相比较,IRI3d、IRI7d、DAPT3d亚组汇管区hes1蛋白表达水平明显高于SO组相同时间点亚组,差异有统计学意义(P<0.05),DAPT7d亚与SO7d亚组的hesl蛋白表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；与IRI组比较,DAPT3d、DAPT7d汇管区hesl蛋白表达水平明显低于IRI组相同时间点亚组,差异有统计学意义(P<0.05)；SO3d和SO7d亚组间hesl蛋白表达水平比较差异无统计学意义(p>0.05)：IRI组、DAPT组3d亚组的Hes1水平明显高于7d亚组,差异有统计学意义(P<0.口5)。5电镜观察汇管区细胞超微结构的变化：电镜下可见SO组各时间点胆管上皮细胞和血管内皮细胞形态结构清晰,核膜、核仁清晰；细胞器结构正常；IRI组及DAPT组术后第3天可见血管内皮细胞损伤及胆管上皮细胞缺氧改变较SO组严重,且DAPT组胆管上皮及血管内皮细胞损伤术后3天较IRI组术后第3天更重,可见胞核、胞质损伤严重,血管腔内可见异常形态红细胞。两组术后第7天上述损伤减轻。6HE染色观察肝脏组织病理变化：SO组肝细胞无变性、坏死,肝小叶结构清楚；汇管区胆管结构清晰、完整,胆管周围毛细血管丛结构无明显改变。IRI组及DAPT组术后3天见肝小叶损伤、胆管及胆管周围血管丛损伤较假手术组严重,而DAPT组较IRJ组损伤加重,可见到更多胆管淤胆及毛细血管管腔内可见红细胞淤积及微血栓形成等现象；且两组术后第7天上述改变好转,而DAPT组术后7天汇管区可有有胆管增生表现。[结论]1、参照周杰等的方法成功建立的大鼠自体原位肝移植胆道缺血再灌注损伤模型是一个可靠的、重复性好的动物模型,可操作性强。该模型有效地避免了移植术后排斥反应、免疫抑制剂等因素对实验的干扰,有利于我们更加可控地对大鼠胆道缺血再灌注损伤进行研究。2、通过检测肝脏汇管区D114、Notch1、hes1、CD34的表达变化,结果表明：胆道缺血再灌注损伤后,Notch信号通路被激活,有效地促进了胆道周围微血管形成,Notch信号通路对胆道缺血再灌注损伤后胆道周围血管丛的再生具有重要的调控作用。