肉中蛋白质N-糖基化分析及其在常见肉类掺假鉴别中的应用

来源 :南京农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:liongliong518
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肉因其较高的营养价值和独特的风味而成为广大消费者饮食中最重要的组成成分之一。在高额利益的驱动下,肉及肉制品的加工生产中掺假问题频繁发生。质谱、PCR、红外光谱、高光谱等技术是目前肉及其加工制品掺假检测常用的方法,但均有各自的局限性。因此,仍然需要开发出能够对肉类掺假进行定性定量鉴别的新技术,以弥补现存方法的不足,满足市场监管的需求。蛋白质N-糖基化修饰是重要的蛋白质翻译后修饰,其形成的不同结构的N-链寡糖反映了细胞表达过程中的基因遗传背景,在不同物种间具有特异性。基于此,分析不同肉中N-链寡糖组的结构差异进而开发以N-链寡糖为生物标志物的肉类真伪鉴别新方法具有明显的创新性和重大意义。本论文以牛肉、鸡肉、猪肉、鸭肉、羊肉等常见肉为研究对象,建立肉中N-链寡糖组的提取方法,以UPLC进行分离检测,利用MALDI-TOF-MS/MS解析了五种肉中N-链寡糖组的详细结构,并进行了差异分析。在此基础上,建立了基于肉中N-链寡糖组UPLC图谱分析的二元掺假肉、三元掺假肉和加工肉制品掺假的鉴别方法。此外,还建立了以物种特征性N-链寡糖结构为鉴别目标的、基于UPLC-ESI-MS/MS分析为基础的牛肉掺假鸭肉或猪肉的高效检测方法。具体研究内容和结果如下:1.五种肉中N-链寡糖组的提取、分析和结构解析以牛肉为代表,设计三种不同的N-链寡糖酶切前处理方式,包括匀浆提取、超声提取和直接酶切三种肉蛋白处理方式,最终选取直接酶切的方式用于后续的N-链寡糖组提取。所建立的肉中N-链寡糖组提取方法重复性好,以该方法重复六次,所得每一个N-链寡糖液相峰RPA占比的RSD均小于10%。对五种肉中的N-链寡糖组进行UPLC分离,根据液相峰的GU值推断其可能的结构,收集液相单峰进行MALDI-TOF-MS/MS检测,进而解析N-链寡糖组的结构。结果表明:五种肉中N-链寡糖组结构差异显著。其中,牛肉、鸡肉、猪肉、鸭肉、羊肉中分别检测到19、22、20、19、22种寡糖结构。以高甘露糖型、岩藻糖基化和唾液酸化三种主要糖型占比进行分析,五种肉中N-链寡糖组成差异较大。2.基于肉中N-链寡糖组UPLC分析的肉类掺假鉴别收集五种肉的N-链寡糖组UPLC图谱中相对峰面积占比大于1%的液相峰,按照GU值从小到大的顺序建立数据集。PCA分析结果表明:基于N-链寡糖组UPLC分析能够成功鉴别五种肉。以鸭肉掺假牛肉为二元掺假肉模型、猪肉和鸡肉同时掺假牛肉为三元掺假肉模型,利用PCA和PLS建模对所得掺假肉样数据进行分析,所建方法能够定性定量鉴别二元掺假肉和三元掺假肉,且检出限LOD为2.2%。经水煮、煎炸、焙烤、微波、高压等五种肉类常见加工方式处理后,肉样中的N-链寡糖组无显著变化,所建该方法能应用于加工肉制品的掺假鉴别。3.基于特征性N-链寡糖结构UPLC-ESI-MS/MS分析的肉类掺假鉴别以牛肉特征N-链寡糖F1M5A1G1S1(Ac),猪肉特征N-链寡糖M5A2G1G2(α)S1(Ac)和鸭肉特征N-链寡糖F1A3G1、A3G2、F1A3G2为分析对象,检测到五种结构在UPLC-ESI-MS 中的质荷比分别为:1118.90[M-2H]2-、1207.65[M-2H]2-、914.85[M+2H]2+、922.85[M+2H]2+、995.85[M+2H]2+。以五种N-链寡糖 UPLC-ESI-MS 中的质荷比为母离子,每种N-链寡糖结构二级质谱中三个响应强度高的产物离子为子离子,构建MRM分析方法定性定量鉴别鸭肉掺假牛肉和猪肉掺假牛肉。所建方法猪肉掺假的LOD为0.88%,鸭肉掺假的LOD为0.26%,平均回收率在105%-115%之间。
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