研究背景:2型糖尿病(type 2 diabetes,T2D)是目前最常见的慢性代谢性疾病,已经成为中老年患病和死亡的第三大主要病因。然而据统计学研究表明,几乎所有糖尿病患者中只有一半(50.3%)被诊断而且得到治疗,还有将近一半的患者未得到及时诊断与治疗。尽管目前临床上有多种抗糖尿病药物,但是也只能改善患者症状,延缓病程,而且存在较明显的药物毒副作用等问题一直是该病治疗的瓶颈。因此,针对T2D发病的新机制和新靶点药物研究迫在眉睫。高血糖是T2D的典型特征,在2002年研究者发现在葡萄糖刺激下,硫氧还蛋白互作蛋白(thioredoxin-interacting protein,TXNIP)表达上调最为明显,且在T2D小鼠模型中TXNIP水平显著升高,揭示TXNIP在T2D病理过程中的重要作用。在T2D患者中,高浓度葡萄糖通过基因转录过程诱导TXNIP的表达上调,而TXNIP则通过miR-204抑制胰岛素的分泌,导致血糖进一步升高,引发糖毒性导致胰岛β细胞的凋亡;此外,TXNIP的上调还会介导细胞氧化应激、内质网应激、细胞炎症反应以及细胞自噬,而且胰岛β细胞本身缺少抗氧化防御系统,使得胰岛β细胞因长期处于应激状态而发生凋亡,胰岛β细胞数量的减少导致胰岛素分泌的严重不足加重了 T2D的病理进程。因此,靶向TXNIP的药物开发在治疗T2D中具有较好的治疗前景。目前已经报道了多种天然化合物及其衍生物可以降低TXNIP水平,也在动物体内验证了其降血糖效果,但是这些化合物作用机制比较广泛,特异性不高,临床应用前景低。针对该问题,一方面我们对TXNIP降解的机制进行研究,以期获得TXNIP的新机制;同时我们以TXNIP为靶点进行一系列药物筛选实验,获得更优更好的先导化合物,以期用于临床。研究方法:1.CRISPR-Cas9技术用于β细胞PKACα的敲除;2.实时荧光定量PCR、Western blotting法检测PKA Cα敲除后对TXNIP以及炎症因子表达的影响、检测PKCs抑制剂对由高糖和毒胡萝卜素(thapsigargin,THAP)诱导的内质网应激基因以及炎症因子表达的影响以及检测Luteolin对由THAP诱导的内质网应激基因与蛋白以及炎症因子表达的影响;3.葡萄糖刺激胰岛素分泌(GSIS)实验用于检测各种处理下胰岛β细胞分泌胰岛素的能力;4.双分子荧光互补技术(BIFC)、免疫共沉淀(Co-IP)实验用于检测PKA Cα与TXNIP的相互作用,Co-IP用于检测PKCβ与TXNIP和PP2A的相互作用;5.Hoechst核染实验、凋亡试剂盒法检测PKC抑制剂对由THAP和高糖诱导的细胞凋亡的影响;流式细胞术(FACS)检测Luteolin对由THAP诱导的细胞凋亡的影响。研究结果:1.PKA Cα介导TXNIP降解的机制研究。在敲除PKA Cα的β细胞中,β细胞胰岛素分泌能力下降、TXNIP与炎症因子表达上调,而且Exendin-4对升高的TXNIP与炎症因子水平无影响;在敲除PKACα的β细胞中重新表达PKACα,β细胞胰岛素分泌能力增强,TXNIP与炎症因子表达下降,Co-IP实验结果显示,PKA Cα与TXNIP相互作用;2.PKCβ抑制剂介导TXNIP降解的机制研究。在β细胞中过表达PKCβ,β细胞核固缩、细胞数量减少、内质网应激相关基因及炎症因子表达急剧升高;而阻断PKC可以抑制由THAP以及高糖诱导的细胞凋亡、TXNIP水平及炎症因子的表达,PKC的抑制还可以改善β细胞的功能,Co-IP实验结果显示,PKCβ、TXNIP及PP2A相互作用;3.针对TXNIP的药物筛选研究。Luteolin呈浓度依赖性抑制THAP和高糖诱导的TXNIP的表达,进一步实验表明Luteolin可以抑制内质网应激基因、HNF4α信号通路基因与炎症因子的表达以及β细胞凋亡;Luteolin还可以维持β细胞内钙离子的稳态;敲低HNF4α会降低Luteolin的作用效果。研究结论:我们的研究首次发现Exendin-4主要是通过PKA Cα促进TXNIP磷酸化,促进其通过蛋白酶途径降解,进而保护了 β细胞功能;同时我们也发现PKCβ通过募集PP2A与TXNIP发生相互作用,维持了其稳态,导致β细胞功能受损,而抑制PKCβ后,则显著改善β细胞的功能。针对TXNIP药物筛选过程中,我们发现天然药物Luteolin可以抑制THAP和高糖诱导的TXNIP的表达,而其主要通过抑制HNF4α信号通路进而维持细胞钙离子稳态,抑制细胞凋亡,而且Luteolin毒性小,作用较强,来源广泛,因此极有可能被开发成为一类安全高效的抗T2D药物。