非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是发达国家最常见的肝脏疾病。全球患病率在25%左右,我国也高达15%。NAFLD正成为全球关注的公共健康问题之一。NAFLD与胰岛素抵抗和代谢综合征有关,针对胰岛素抵抗状态的2型糖尿病而应用的治疗方法对于治疗NAFLD有一定的效果,例如控制体重,二甲双胍和噻唑烷二酮类药物的应用等。在肥胖人群中NAFLD患病率高达80%,非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis,NASH)是NAFLD非常严重的病理进程,约占所有NAFLD患者15%-25%,被认为是导致肝硬化的主要原因。miRNA是内源的,非编码的约19-25个核苷酸的非编码小RNA片段。根据个体序列的不同它能够识别其靶m RNA的3’端非编码区(3’-untranslated region,3′-UTR)特异性结合位点,从而导致翻译阻遏或m RNA降解。miRNA在细胞增殖,发育,分化和凋亡中起到重要的调控作用。miRNA在许多慢性肝病的发展中也起到了重要的作用,包括病毒性肝炎,药物诱导的肝损伤和自身免疫性肝病等。本研究通过胆碱-蛋氨酸缺乏(Methionine-choline deficient,MCD)饮食建立NASH相关肝纤维化动物模型,应用m RNA芯片、生物信息学分析、双荧光素酶报告基因系统、星状细胞模型培养、实时定量PCR(QRT-PCR)、蛋白印记(Western blot)、MTT、流式细胞学、si RNA转染及靶标蛋白恢复试验等技术方法。通过肝星状细胞实验,从星状细胞活化、增殖、凋亡及胶原分泌等多方面阐明miR-130a-3p通过直接调控TGFBRs对NASH相关肝纤维化的作用及机制。本研究结果有助于肝纤维化的发病机制的深入理解,并为治疗NAFLD提供潜在可能的药物新靶点。第一部分小鼠MCD模型的NASH相关肝纤维化后肝组织差异表达miRNAs的筛选与验证目的:筛选MCD模型的NASH相关肝纤维化小鼠肝组织显著差异表达的miRNAs,并进行验证。方法:选用MCD饮食饲喂8周龄雄性C57BL/6J小鼠,构建NASH相关肝纤维化小鼠模型。评价小鼠血清生化学及肝组织病理学指标变化,选用LC Sciences micro RNA Microarray-20.0 Mouse miRNA基因表达谱芯片分析NASH相关肝纤维化差异表达miRNAs。通过统计学筛选后,采取实时定量PCR进行验证。结果:1血清ALT及AST水平,NASH相关肝纤维化小鼠MCD模型组显著高于对照组(P<0.01)。2实验小鼠肝组织病理学:MCD模型NASH相关肝纤维化小可见脂肪变性肝细胞及“风帆样膨大”现象,坏死灶偶见,伴区带不均一性增强,以三区为主,肝窦周间隙纤维组织增生。与正常对照组差异显著。3 NASH相关肝纤维化小鼠肝组织miRNAs差异表达谱:NASH相关肝纤维化小鼠肝组织有37个差异表达的miRNAs(P<0.05),其中miR-582-3p、miR-210-3p、miR-211-5p、miR-7215-5p、miR-216a-5p等19个miRNAs在模型组的肝组织中表达明显上调;miR-335-5p、miR-130a-3p、miR-7236-3p、miR-146a-5p、miR-30a-5p等18个miRNAs在模型组的肝组织中表达明显下调。4差异表达miRNAs的验证:实时定量PCR结果显示:miR-582-3p表达较Control组明显上调,miR-130a-3p及miR-335-5p表达明显下调,均有显著差异(P<0.05),与芯片结果一致。第二部分差异表达miRNAs的生物信息学分析及靶基因的选择与验证目的:生物信息学方法分析预测miRNAs在NASH相关肝纤维化中的靶基因并进行双荧光及组织学的验证。方法:采用生物信息学方法并进行GO(Gene Ontology)分析及KEGG(Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes)信号通路分析。并进行靶基因预测,结合NASH发病机制的相关通路确定目标靶基因。应用双荧光素酶报告基因系统证实miR-130a-3p与靶基因TGFBR1和TGFBR2特异结合性。在小鼠模型组织中进行靶基因及相关因子的原位杂交、免疫组化验证及m RNA和蛋白的验证。并且在NASH患者的组织中进行印证。结果:1差异表达miRNAs靶基因预测及生物信息学分析:共注释19069潜在目的靶基因,其中671个基因只与下调miRNAs相关,920个基因只与上调miRNAs相关,17478个基因与下调及上调miRNAs均相关。下调差异表达miRNAs靶基因的功能显著富集于细胞骨架,离子结合,RNA调节代谢过程,Wnt信号通路和TGF-β/SMAD信号通路、凋亡通路及ECM-受体相互作用信号通路等。上调差异表达miRNAs靶基因的功能显著富集于线粒体,DNA结合,转录,Wnt信号通路和MAPK信号传导、胰岛素信号通路、ECM-受体相互作用及凋亡通路等。2 miR-130a-3p与靶基因特异性结合验证:应用五种miro RNA靶基因预测软件(Targetscan、miRanda、miRDB、PITA和RNA22)共同预测miR-130a-3p的靶基因,其中TGFBR1 3′-UTR及TGFBR2 3′-UTR均存在与miR-130a-3p的结合位点。采用双荧光素酶报告基因验证靶基因与miR-130a-3p的结合关系,结果显示:与对照组相比,TGFBR1/2基因3′-UTR野生型质粒与miR-130a-3p mimics共转染HK 293T细胞后,显著降低报告基因的荧光素酶活性(P<0.05),与miR-130a-3p inhibitor共转染后,显著增加报告基因的荧光素酶活性(P<0.05)。而miR-130a-3p mimics、mimics control、miR-130a-3p inhibitor、inhibitor control对TGFBR1及TGFBR2基因3′-UTR突变型质粒荧光素酶活性无明显影响(P>0.05)。3 miR-130a-3p与靶基因及相关因子在肝组织中的证实:3.1)在小鼠组织中的验证:3.1.1)肝组织纤维化相关基因TGFBR1、TGFBR2、smad2、smad3、Col-1及Col-4 m RNA及蛋白表达水平MCD组与对照组相比表达明显增多(P<0.05)。3.1.2)肝组织切片MCD组与对照组相比,原位杂交结果提示miR-130a-3p表达明显减少。免疫组化结果提示:TGFBR1、TGFBR2、Col-1及Col-4表达明显增多。3.2)在患者组织切片中的印证:NASH患者相关肝纤维化肝组织显示大泡肝细胞脂肪变性为主,可伴有点灶状坏死及炎症细胞浸润,肝窦周间隙纤维组织增生。与对照组相比,NASH患者相关肝纤维化患者组的肝组织原位杂交结果提示:miR-130a-3p表达明显减少。免疫组化结果提示:TGFBR1、TGFBR2、Col-1及Col-4表达明显增多。第三部分miR-130a-3p在NASH相关肝纤维化中的作用及机制研究目的:深入阐明miR-130a-3p对肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)功能的调控,探明miR-130a-3p对NASH相关肝纤维化发生发展的作用。方法:通过肝星状细胞HSC-T6进行体外培养,检测HSC活化过程中miR-130a-3p及靶基因的0d、1d、3d及7d表达变化。同时,将miR-130a-3p模拟物(Mimics)转染至肝星状细胞系过表达,MTT检测增殖、流式细胞分析法(Annexin V/PI)及相关凋亡因子检测凋亡率。采用实时荧光定量PCR及Western-blot分析其靶基因以及下游信号分子及肝纤维化相关因子的表达变化。详细探讨miR-130a-3p通过作用其靶基因TGFBR1及TGFBR2对脂肪性肝纤维化的作用机制。结果:1肝星状细胞活化过程中(0d、1d、3d及7d)miR-130a-3p及靶基因的表达变化:1.1)miR-130a-3p表达1d较0d,7d较3d显著降低(P<0.05)。1.2)m RNA表达:TGF-β1,1d较0d、3d较1d、7d较3d显著增加(P<0.05);α-SMA,3d较1d显著增加(P<0.05);Smad2,7d较3d显著增加(P<0.05);Smad3,7d较3d显著增加(P<0.05)。蛋白表达:TGF-β1,1d较0d、3d较1d、7d较3d显著增加(P<0.05);α-SMA,1d较0d、3d较1d、7d较3d显著增加(P<0.05);Smad2,1d较0d、3d较1d、7d较3d显著增加(P<0.05);Smad3,3d较1d、7d较3d显著增加(P<0.05)。1.3)m RNA表达:TGFBR1,3d较1d、7d较3d显著增加(P<0.05);TGFBR2,3d较1d显著增加(P<0.05)。蛋白表达:TGFBR1,1d较0d、3d较1d、7d较3d显著增加(P<0.05);TGFBR2,1d较0d、3d较1d、7d较3d显著增加(P<0.05)。2肝星状细胞中miR-130a-3p的过表达[miR-130a-3p mimics(M)组、Control(C)组及mimics control(MC)组]:2.1)miR-130a-3p m RNA水平:M组较C组及MC组明显增加(P<0.05),转染48 h后较转染初期(0 h)明显增加(P<0.05)。2.2)增殖率:48h、72h,M组较C组及MC组明显降低(P<0.05)。2.3)肝星状细胞凋亡的影响:2.3.1)凋亡率:M组较C组及MC组明显增加(P<0.05);2.3.2)凋亡相关因子:m RNA表达:Caspase-3、Caspase-9及PARP-1,M组较C组及MC组明显增加(P<0.05);蛋白表达:Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9及Cleaved PARP-1,M组较C组及MC组明显增加(P<0.05)。2.4)miR-130a-3p过表达对肝星状细胞活化及分泌胶原功能的影响:m RNA及蛋白表达:TGF-β1、Smad2、Smad3、Col-1、Col-4、MMP-2及MMP-9,M组较C组及MC组明显增加(P<0.05)。2.5)TGFBR1及TGFBR2 m RNA及蛋白表达,M组较C组及MC组明显增加(P<0.05)。第四部分miR-130a-3p靶基因TGFBR1及TGFBR2的敲减及功能恢复实验目的:证实TGFBR1和TGFBR2在肝纤维化中的重要作用,并确定TGFBR1和TGFBR2为miR-130a-3p在NASH相关肝纤维化中主要的靶点。方法:通过肝星状细胞HSC进行体外培养,并应用si RNA转染技术沉默TGFBR1及TGFBR2,进行敲减实验。将miR-130a-3p mimics与TGFBR1及TGFBR2野生型质粒共转染至肝星状细胞系,进行靶标蛋白恢复试验。检测星状细胞活化时靶基因TGFBRs、TGF-β/SMAD下游信号分子及肝纤维化相关因子的变化。进一步证实miR-130a-3p通过作用其靶基因TGFBR1及TGFBR2对脂肪性肝纤维化作用机制的确切性。结果:1 si RNA沉默TGFBR1及TGFBR2对TGF-β/SMAD下游信号分子及肝纤维化相关因子的作用[Control(C)组、si-Control(SC)组、si-TGFBR1(S1)组、si-TGFBR2(S2)组及(si-TGFBR1+si-TGFBR2)(SA)组]:1.1)si RNA沉默TGFBR1及TGFBR2沉默效率的检测:m RNA及蛋白表达:TGFBR1,S1组、SA组均较C组显著减少(P<0.05);TGFBR2,S2组、SA组均较C组显著减少(P<0.05)。1.2)si RNA沉默TGFBR1及TGFBR2对TGF-β/SMAD下游信号分子的影响:m RNA及蛋白表达:TGF-β1,S1组、S2组及SA组较C组无明显变化(P>0.05);α-SMA,Smad2及Smad3,S1组、S2组及SA组均较C组及SC组显著减少(P<0.05)。1.3)si RNA沉默TGFBR1及TGFBR2对肝纤维化相关因子的作用:m RNA及蛋白表达:MMP-2、MMP-9、Col-1及Col-4,S1组、S2组及SA组均较C组及SC组显著减少(P<0.05)。2采用miR-130a-3p mimics与TGFBR1及TGFBR2质粒共转染进行恢复试验的结果[Control(C)组、mimics-Control(MC)组、miR-130a-3p mimics(M)组、miR-130a-3p mimics+TGFBR1(M1)组、(miR-130a-3p mimics+TGFBR2(M2)组及miR-130a-3p mimics+TGFBR1+TGFBR2(MA)组]:2.1)对TGFBR1及TGFBR2的影响:m RNA表达:TGFBR1,M组较C组表达显著减少(P<0.05),MA组较M组表达显著增多(P<0.05)。TGFBR2,M组较C组表达显著减少(P<0.05),M2组及MA组均较M组表达显著增多(P<0.05)。蛋白表达:TGFBR1,M组较C组表达显著减少(P<0.05),M1组及MA组较M组表达显著增多(P<0.05);TGFBR2,M组较C组表达显著减少(P<0.05),M2组及MA组均较M组表达显著增多(P<0.05)。2.2)对TGF-β/SMAD下游信号分子及肝纤维化相关因子的作用:m RNA表达:TGF-β1,M组较C组比较无统计学意义(P>0.05);Smad2,M组较C组比较显著减少(P<0.05)、MA组较M组表达显著增多(P<0.05);Smad3,M组较C组显著减少(P<0.05)、MA组较M组显著增多(P<0.05);Col-1,M组较C组显著减少(P<0.05)、MA组较M组显著增多(P<0.05);Col-4,M组较C组显著减少(P<0.05)、MA组较M组显著增多(P<0.05)。蛋白表达:TGF-β1,M组较M1组显著减少(P<0.05)、M组较M2组显著减少(P<0.05)、M组较MA组显著减少(P<0.05);Smad2,M组较C组显著减少(P<0.05)、M2组较M组显著增多(P<0.05)、MA组较M组显著增多(P<0.05);Smad3,M组较C组显著减少(P<0.05)、M2组较M组显著增多(P<0.05)、MA组较M组显著增多(P<0.05);Col-1,M组较C组显著减少(P<0.05)、M1组较M组显著增多(P<0.05)、M2组较M组显著增多(P<0.05)、MA组较M组显著增多(P<0.05);Col-4,M组较C组显著减少(P<0.05)、M1组较M组显著增多(P<0.05)、M2组较M组显著增多(P<0.05)、MA组较M组显著增多(P<0.05)。结论:1 MCD饮食能够成功建立C57BL/6J小鼠NASH相关肝纤维化动物模型,为充分研究该病发病机理提供了良好保证。2小鼠肝脏组织中miRNAs在NASH相关肝纤维化进程中变化显著。差异表达的miRNAs可能参与了NASH相关肝纤维化的发生发展,并参加病理机制的调控。3 miR-130a-3p在NASH相关肝纤维化肝组织中及肝星状细胞活化过程中表达显著降低,能抑制星状细胞增殖、活化及分泌胶原、并且诱导凋亡,从而延缓或阻止肝纤维化的进展。4敲减TGFBRs实验和Rescue实验结果提示,miR-130a-3p延缓NASH相关肝纤维化发生发展的作用可能主要是通过特异性抑制靶基因TGFBR1及TGFBR2而实现的。